蛇床子素对冠脉结扎致心肌梗死大鼠的影响

王 皓， 李素敏， 兰本超， 王少学， 李景昉， 孙永琨

（1. 新乡医学院基础医学院， 河南 新乡 453003； 2. 河南省原阳县人民医院， 河南 新乡 453500；3. 河南省医用组织再生重点实验室， 河南 新乡 453003）

急性心肌梗死是一种严重的缺血性疾病， 也是导致死亡的常见原因之一[1］， 它由冠状动脉供血和心肌需求不平衡所造成。 心肌坏死和功能不全的临床标志包括血压、 心律、 心电图改变及左室功能障碍， 同时伴有血清心脏特殊蛋白升高。 心肌梗死不仅给患者带来极大痛苦， 同时也给家庭和社会带来很大的负担， 故对该类疾病的防治是刻不容缓的重大课题。

Notch 信号通路被证实参与心血管疾病发生发展过程，其蛋白至少有5 种Notch 配体（Jagged1～2、 Delta1～3） 和4 种Notch 受体（Notch1 ～4）[2］， 参与梗死愈合和心脏修复[3-4］， 心肌损伤后其激活对心肌具有保护作用。 另外，Notch 信号通路可通过Hes 1 信号来转导蛋白激活缺氧诱导因子（HIF-α）[5］， 后者是心肌梗死后缺氧反应的主要调节因子[6］， 对氧的动态平衡起着关键作用， 在心肌中由于缺氧和氧化应激反应增加而激活的该因子对心脏起着保护作用[7］。

蛇床子素是从蛇床子中提取出的主要活性成分， 能增强Notch1 信号通路活性， 减少大脑中动脉缺血再灌注所致的脑梗塞， 同时减轻海马神经元损伤和凋亡[8］； 对大鼠心肌急性缺血／再灌注损伤也具有保护作用[9-10］， 并能减轻心肌梗死后心肌缺血[11］， 但该成分对急性心肌梗死后心肌损伤保护作用的具体机制， 尤其是其心脏保护作用与Notch 1信号通路之间的关系尚不明确。 因此， 本实验通过结扎大鼠心脏左前降支制备急性心肌梗死模型， 观察蛇床子素对大鼠心脏的保护作用， 并探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级Wistar 大鼠48 只， 体质量200 ～250 g，雌雄各半， 由河南省实验动物中心提供， 动物生产许可证号SYXK （豫） 2011-001。

1.2 仪器 HX-100 动物呼吸机、 BL-420F 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）； 小动物超声仪（森西科技有限公司）； ABI 7300 Real-Time PCR System （美国ABI公司）。

1.3 试药 蛇床子素购自中国食品药品检定研究院（批号110822-200305）。 麝香保心丸购自上海和黄药业有限公司（批号160812）。 Caspase-3、 Caspase-9 活性测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司； 大鼠Notch1 蛋白ELISA 试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司； 大鼠Jagged1 蛋白ELISA 试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司； BeyoRT cDNA 第一链合成试剂盒购自碧云天生物技术研究所；SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 大鼠适应性喂养1 周后， 腹腔注射2%戊巴比妥钠（4 mg／100 g） 麻醉， 仰卧位固定在手术板上，四肢皮下插入针电极， 连接BL-420F 生物机能实验系统描记肢体Ⅱ导联心电图， 经口气管插管， 连接小动物呼吸机。消毒手术区域， 沿左胸骨第3～4 肋间开胸， 放置眼科开睑器制成的开胸器， 暴露心脏， 在心缩期用镊子小心提起心包膜并剪开， 于左心耳与肺动脉圆锥间以左冠状静脉为标识， 左心耳根部下2～3 mm 处结扎冠状动脉左前降支， 结扎后左室壁变苍白， 并出现室壁运动减弱， 心电检测可见Ⅱ导联ST 段明显抬高， 证实结扎成功， 逐层缝合胸部切口， 关胸； 假手术组只穿线不结扎。 术后， 各组大鼠腹腔注射40 万单位青霉素， 连续5 d， 以预防感染。

2.2 分组及给药 随机选取12 只大鼠作为假手术组， 另外取48 只建模大鼠随机分为模型组、 阳性组及蛇床子素低、 高剂量组。 其中， 蛇床子素低、 高组分别腹腔注射该成分20、 40 mg／kg （N， N-二甲基甲酰胺、 吐温-80、 生理盐水按1 ∶1 ∶8 比例溶解蛇床子素， N， N-二甲基甲酰胺为溶解剂， 吐温-80 为助溶剂， 4 ℃下保存， 使用前用生理盐水稀释）， 假手术组、 模型组大鼠腹腔注射同体积生理盐水（含10%N， N-二甲基甲酰胺、 10%吐温-80）， 阳性组大鼠灌胃麝香保心丸溶液（12 mg／kg）， 各组每天给药1 次，连续21 d。

2.3 心电图监测 术前、 术后即刻及给药1、 3、 7、 14、21 d， 大鼠麻醉， 四肢皮下插入针电极， BL-420F 生物机能实验系统描记上述时间点的肢体Ⅱ导联心电图， 观察ST 段变化， 记录S-T 段值。

2.4 超声心动图检查 给药21 d 后， 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（4 mg／100 g） 麻醉， 仰卧位固定后胸部备皮，小动物超声仪（17.5 MHz） 进行心脏超声检查[12］， 项目包括左室舒张末期容积（LVEDV）、 左室收缩末期容积（LVESV）、 左心室舒张末期内径（LVDd）、 收缩末期内径（LVDs）、 左室短轴的缩短率（LVFS）、 每搏量（SV）、 左心室射血分数（LVEF）。

2.5 Caspase-3、 Caspase-9 活性检测 10 mg 缺血区心肌组织加入100 μL 裂解液， 冰浴上用玻璃匀浆器匀浆， 匀浆液转移到1.5 mL 离心管中， 冰浴后再裂解5 min， 4 ℃、16 000×g 离心10～15 min， 上清转移到冰浴预冷的离心管中， 立即测定Caspase 3、 Caspase-9 活性或-70 ℃下保存样品待测， 严格按照相应试剂盒说明书进行操作。

2.6 Notch1、 Jagged1 蛋白表达检测 采用ELISA 法。 取缺血区心肌组织20 mg， 冰生理盐水反复冲洗， 磷酸盐缓冲液配置成10%匀浆， 离心后取上清液， 相应酶联免疫吸附测定试剂盒测定Notch1、 Jagged1 蛋白水平， 严格按照说明书进行操作。

2.7 Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α、 Bax、 Bcl-2 mRNA表达检测 采用实时荧光定量法。 先按照TRIzol 试剂说明书提取缺血心肌组织总RNA， 再用紫外分光光度计测定260、 280 nm 处吸光度， 根据两者比值检测RNA 纯度， 接着通过碧云天cDNA 第一链合成试剂盒反转录生成cDNA，然后应用SYBR-Green 实时荧光定量试剂盒， 以cDNA 为模板， GAPDH 为内参， 进行荧光定量PCR 扩增。 引物序列为Notch1 正 向5′-CTTCGTGCTCCTGTTCTTTG-3′， 反向5′-GCCTCTGACACTTTGAAACC-3′； Hes1 正 向5′-TCGGTGGTTACTTTGTTGCT-3′， 反 向5′-AGGCGCAATCCAATATGAAC-3′； Jagged1 正向5′-CACCCGAACTGGACAAAC-3′， 反向5′-AGCCTCAGACTGGGATAC-3′； HIF-1α 正 向5′-CAGCGATGACACGGAAAC-3′， 反 向5′-AGTGACTCTGGGCTTGAC-3′；Bax 正向5′-AGACACCTGACCTTGGA-3′， 反向5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′； Bcl-2 正向5′-AGACACCTGACCTTGGA-3′， 反向5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′， 反应条件为95 ℃预变性30 s， 95 ℃变性5 s， 60 ℃退火30 s，共45 个循环。 通过检测SYBR-Green 信号强度来定量PCR产物， 以GAPDH 为内参， 各基因相对表达量用2-ΔΔCt表示。

2.8 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理， 数据以） 表示， 组间比较采用单因素方差分析， 两两比较采用LSD 法。 以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠死亡情况 手术过程中及术后， 假手术组大鼠无死亡； 模型制作过程中死亡4 只大鼠（1 只死于麻醉意外，2 只死于失血性休克， 1 只死于心律失常）； 术后24 h 内死亡2 只大鼠， 即分组前共死亡6 只大鼠， 手术成功率87.5%。 分组给药后， 模型组大鼠又死亡1 只， 其他组大鼠无死亡。

3.2 蛇床子素对大鼠体质量、 心脏质量的影响 表1 显示， 实验结束时， 各组大鼠体质量无显著差异（P＞0.05）；与假手术组比较， 模型组大鼠心脏质量、 心脏质量与体质量比值显著增加（P＜0.01）； 与模型组比较， 蛇床子素组两者显著降低（P＜0.01）。

表1 蛇床子素对大鼠体质量、 心脏质量的影响

表1 蛇床子素对大鼠体质量、 心脏质量的影响

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01

假手术组 265.3±11.2 0.798±0.042 0.299±0.021模型组 255.4±12.2 1.153±0.052## 0.453±0.031##麝香保心丸组 258.9±11.6 0.963±0.039∗∗ 0.373±0.029∗∗蛇床子素低剂量组 257.1±9.8 0.992±0.055∗∗ 0.387±0.022∗∗蛇床子素高剂量组 259.9±10.2 0.941±0.045∗∗ 0.362±0.026∗∗

3.3 蛇床子素对大鼠心电图ST 段的影响 图1 显示， 造模后心电图ST 段明显抬高； 随着时间延长， 模型组、 蛇床子素组该值均呈下降趋势（心肌梗死后升高的ST 段可在一定程度上自然恢复）， 以蛇床子素组更明显。

图1 各组大鼠心电图ST 段

表2 蛇床子素对大鼠超声心动图指标的影响

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

假手术组 6.86±0.34 4.83±0.13 382.33±21.33 89.44±7.52 64.83±5.23 71.11±8.43 0.44±0.09模型组 9.83±0.45## 8.11±0.27## 474.52±31.53## 142.33±18.25## 40.12±4.23## 38.83±7.44## 0.30±0.05##麝香保心丸组 8.42±0.31∗∗ 6.94±0.25∗∗ 421.54±38.44∗∗ 116.22±17.64∗∗ 52.96±6.42∗∗ 53.52±8.47∗∗ 0.39±0.08∗蛇床子素低剂量组 8.74±0.34∗ 7.62±0.18∗ 431.34±22.01∗ 127.42±13.13∗ 48.21±4.46∗ 47.52±9.21∗ 0.37±0.06∗蛇床子素高剂量组 8.11±0.24∗∗ 6.22±0.21∗∗ 410.34±32.86∗∗ 113.57±16.73∗∗ 55.73±5.21∗∗ 63.44±10.87∗∗ 0.41±0.09∗∗

3.4 蛇床子素对大鼠心电图指标的影响 表2 显示， 与假手术组相比， 模型组LVDd、 LVDs 显著扩大（P＜0.01），LVEDV、 LVESV 显著增加（P＜0.01）， LVFS、 LVEF、 SV显著下降（P＜0.01）； 与模型组比较， 蛇床子素组LVDd、LVDs 显著缩小（P＜0.05， P＜0.01）， LVEDV、 LVESV 显著下降（P＜0.05， P＜0.01）， LVFS、 LVEF、 SV 显著增加（P＜0.05， P＜0.01）。

3.5 蛇床子素对Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax、 Bcl-2 mRNA 表达的影响 表3 显示， 与假手术组比较， 模型组Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax mRNA 表达显著升高（P＜0.01）， Bcl-2 mRNA 表达显著降低（P＜0.01）； 与模型组比较， 蛇床子素组Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax mRNA表达显著降低（P＜0.05， P＜0.01）， Bcl-2 mRNA 表达显著升高（P＜0.05， P＜0.01）。

表3 蛇床子素对Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax、 Bcl-2 mRNA 表达的影响

表3 蛇床子素对Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax、 Bcl-2 mRNA 表达的影响

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

假手术组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型组 6.85±0.21## 7.15±0.31## 2.31±0.13## 0.41±0.08##麝香保心丸组 3.81±0.31∗∗ 4.89±0.44∗∗ 1.68±0.09∗∗ 0.76±0.12∗∗蛇床子素低剂量组 4.78±0.38∗ 5.73±0.29∗ 1.91±0.11∗ 0.61±0.11∗蛇床子素高剂量组 3.34±0.25∗∗ 3.42±0.24∗∗ 1.32±0.12∗∗ 0.75±0.09∗∗

3.6 蛇床子素对Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α mRNA表达的影响 图2 显示， 与假手术组比较， 模型组Notch1、HIF-1α mRNA 表达显著增加（P ＜0.05）， Hes1、 Jagged1 mRNA 表达有所增加， 但无显著性差异（P＞0.05）； 与模型组比较， 蛇床子素组Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α mRNA 表达显著增加（P＜0.01）。

3.7 蛇床子素对Notch1、 Jagged1 蛋白表达的影响 图3显示， 与假手术组比较， 模型组Notch1 蛋白表达显著增加（P＜0.05）， Jagged1 蛋白表达有所增加， 但无显著性差异（P＞0.05）； 与模型组比较， 蛇床子素组Notch1、 Jagged1蛋白表达显著升高（P＜0.01）。

4 讨论

图2 蛇床子素对Notch1、 Hes1、 Jagged1、 HIF-1α mRNA 表达的影响

心肌梗死明确诊断的主要标准之一就是心电图异常，ST 段抬高可反映缺血区和非缺血区电位差的差异， 以及随后细胞膜功能的丧失， 无论是心肌梗死患者[13］还是异丙肾上腺素诱发的心肌梗死大鼠[14］都可见该现象。 本实验发现， 与模型组比较， 蛇床子素组心电图ST 段明显下降， 给药21 d 后心脏质量、 心脏与体质量的比值、 LVEDV、LVESV、 LVDd、 LVDs 明显降低， LVFS、 LVEF、 SV 明显增加， 表明该成分对急性心肌梗死大鼠心肌损伤和心功能有明显改善作用。

图3 蛇床子素对Notch1、 Jagged1 蛋白表达的影响

心肌梗死常在心肌血供突然中断或持续时发生， 心肌细胞凋亡明显， 同时凋亡也是动脉微血栓形成的主要原因[15］。 Bcl-2、 Bax 都属于Bcl-2 家族， 在细胞凋亡过程中起着重要的作用， 其中前者是抗凋亡蛋白， 而后者是促凋亡蛋白， 两者比值是凋亡发生与否的决定性因素[16］；Caspase 是进化上保守的半胱氨酸蛋白酶， 在细胞凋亡的启动和执行中起着举足轻重的作用[17］， 其中Caspase-3 是一种执行分子， 在正常和病理状态下是最丰富的Caspase， 它激活DNA 酶时最终导致DNA 断裂和细胞死亡[18］， 而Caspase-9 具有促进Caspase-3 激活的作用[19-20］， 两者参与心肌梗死过程[21-22］， 抑制其活性时可明显减轻缺血所致心肌细胞凋亡， 提高心脏功能[23］。 本实验发现， 蛇床子素可明显降低Caspase-3、 Caspase-9 活性及Bax mRNA 表达， 提高Bcl-2 mRNA 表达， 表明该成分能减少细胞凋亡， 保护心肌细胞， 提高心功能。

HIF 作为细胞核转录调节因子， 由HIF-1α 和HIF-1β组成， 其中前者对缺氧敏感而稳定， 在心肌缺血早期[24］、晚期[25］都发现其表达增多， 心肌梗死所诱导的心肌缺血缺氧部位中其表达上调对心脏具有保护作用[25-27］。 另外， 梗死部位缺血会持续很多天后才会发展到晚期阶段， 在梗死后4 周， 固有HIF-1α 表达升高会减轻梗死面积， 提高心功能[28］。 本实验发现， 蛇床子素能明显增加HIF-1α mRNA表达， 并且具有剂量依赖性的关系。

Notch 信号通路对调节细胞增殖、 分化、 凋亡起着关键性作用， 心肌缺血缺氧环境会使其激活， 通过增强心肌再生、 保护缺血心肌或诱导血管再生来减轻心肌损伤， 并提高心功能[29-30］， 它被激活后会增加抗凋亡因子Bcl-2 表达，同时降低心力衰竭标志物Myh6、 Myh7、 Glut-1 表达及促凋亡蛋白酶Caspase-9 活性， 抑制心肌细胞凋亡[30-31］， 而该信号通路在增殖的胚胎和未成熟的心肌细胞， 或在梗死后心肌的边缘部位都会激活[31］； Jagged1 是成熟的心肌细胞中Notch1 受体的主要配体之一[32］， 外源性的给予该配体后可激活Notch1， 进而减轻心肌损伤[30］。 还可上调Hes-1、Hey-1 mRNA 表达， 表明两者参与Notch 信号通路对心肌的保护作用[31］。 本实验发现， 与假手术组比较， 模型组大鼠心肌组织Notch1、 HIF-1α mRNA 表达及Notch1 蛋白表达明显增加， Hes1、 Jagged1 mRNA 表达及Jagged1 蛋白表达也有增加趋势， 但无显著性差异， 表明心肌缺血缺氧在一定程度上激活了Notch 信号通路， 与文献[7， 33］ 报道一致； 与模型组比较， 蛇床子素能明显增加Notch1、 Hes1、Jagged1 mRNA 表达及Notch1、 Jagged1 蛋白表达， 表明该成分能显著激活Notch1／Jagged1 信号通路， 从而发挥对缺血心肌的保护作用。

综上所述， 蛇床子素可减轻急性心肌梗死大鼠心肌损伤， 提高心功能， 还能增加心肌组织HIF-1α， Notch1、 Jagged1 水平， 表明该成分对心脏的保护作用可能与上调HIF-1α 和激活Notch1／Jagged1 信号通路有关。 同时， HIF-1α、Notch1／Jagged1 信号途径在将来也可能是潜在的缺血性心脏病治疗靶点。