肝宝胶囊HPLC 指纹图谱建立及5 种成分同时测定

范 兴， 安 昌， 陈 鸣， 杨成梓， 黄德福∗

（1. 福建医科大学孟超肝胆医院， 福建 福州 350025； 2. 福建中医药大学药学院， 福建 福州 350122）

肝宝胶囊为福建医科大学孟超肝胆医院名老中医的临床经验方， 是由青果、 虎杖、 谷芽、 麦芽、莱菔子组成的纯中药制剂， 适用于脂肪肝及急、 慢性肝炎之肝热积滞证[1-4］， 临床上应用近20 年， 疗效确切。 但肝宝胶囊现行质量标准不全面， 仅采用TLC 法定性鉴别大黄素， 并且尚无相应指标性成分的含有量测定， 无法客观反映其内在质量。 为了更有效地控制肝宝胶囊质量， 保证各批次间稳定性和临床疗效， 本实验建立该制剂HPLC 指纹图谱， 并测定其中5 种成分的含有量[5-6］， 以期为其质量控制提供实验依据。

1材料

1.1 仪器 LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）； KQ-250E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； 电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； Milli-Q 型超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试药 没食子酸（批号Y09A7Y17058） 对照品购自上海源叶生物科技有限公司， 含有量≥98%； 芥子碱硫氰酸盐（批号111702-200501）、 虎杖苷 （批号111575-200502）、 白藜芦醇 （批号111535-200502）、 大黄素 （批号110756-200110）对照品均购自中国食品药品检定研究院， 含有量均≥98%。 13 批肝宝胶囊由福建医科大学孟超肝胆医院制剂室制备（每粒装0.34 g， 批号161108、161219、 161226、 170218、 170222、 170302、170304、 170308、 170319、 170321、 170324、170401、 170504， 编号S1～S13）。 青果、 虎杖、 谷芽、 麦芽、 莱菔子购自福建省药材有限公司， 经福建中医药大学杨成梓教授鉴定均为正品， 均符合2015 年版《中国药典》 一部相关项下规定。 甲醇、乙腈为色谱纯； 其他试剂均为分析纯； 水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Platisil-C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相乙腈-0.1%磷酸， 梯度洗脱（0～5 min， 3%乙腈； 5 ～10 min， 3%→12%乙腈； 10 ～20 min， 12% 乙腈； 20 ～70 min， 12% →35% 乙 腈； 70 ～75 min， 35% →65% 乙 腈； 75 ～90 min， 65% →70% 乙腈）； 体积流量1 mL／min；柱温30 ℃； 检测波长305 nm； 进样量7 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、 芥子碱硫氰酸盐、 虎杖苷、 白藜芦醇、 大黄素对照品适量， 置于棕色量瓶中， 甲醇制成质量浓度分别为537.93、 284.43、 2 312.57、 52.98、 105.03 μg／mL的溶液， 即得。

2.3 供试品溶液制备 精密称取胶囊内容物约0.34 g， 置于具塞锥形瓶中， 精密加入20 mL 甲醇， 密塞， 称定质量， 超声 （250 W、 40 kHz）30 min， 放冷， 甲醇补足减失的质量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 0.45 μm 微孔滤膜过滤， 即得。

2.4 单味药与阴性样品溶液制备 按处方比例及工艺， 分别制备缺青果、 虎杖、 莱菔子的阴性样品， 按“2.3” 项下方法制备， 即得。

2.5 HPLC 指纹图谱

2.5.1 精密度试验 取胶囊内容物（编号S6），按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次， 以11 号峰（虎杖苷） 为参照峰， 测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.32%， 相对峰面积RSD 均小于1.59%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取胶囊内容物（编号S6），按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 于0、 2、 4、8、 12、 24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以11 号峰（虎杖苷） 为参照峰， 测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.32%， 相对峰面积RSD均小于1.59%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取胶囊内容物（编号S6），按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 以11 号峰（虎杖苷） 为参照峰， 测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.32%， 相对峰面积RSD 均小于1.91%，表明该方法重复性良好。

2.6 建立方法

2.6.1 相似度评价 取胶囊内容物（编号S1 ～S13）， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 结果见图1， 共标定出19 个共有峰， 由于11 号峰（虎杖苷） 峰面积较大， 峰形良好， 出峰时间较稳定， 故选择其作为参照峰（S）。 然后， 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A 版） 进行分析， 以S6为参照峰进行色谱峰自动匹配， 采用中位数法生成对照指纹图谱， 测得13 批样品相似度分别为0.987、 0.985、 0.999、 0.992、 0.990、 0.997、0.998、 0.997、 0.987、 0.986、 0.993、 0.998、0.994， 均大于0.9， 表明各批次样品之间的质量相对稳定。

2.6.2 共有峰指认归属 通过各峰保留时间、紫外光谱图信息并结合对照品， 确认出其中5 个色谱峰， 分别为4 号峰没食子酸、 7 号峰芥子碱硫氰酸盐、 11 号峰虎杖苷、 16 号峰白藜芦醇、19 号峰大黄素。 然后， 将各单味药材、 阴性对照图谱、 肝宝胶囊指纹图谱进行比对， 确认了19个共有峰主要来自青果、 虎杖、 莱菔子， 其中1 ～6、 8 ～10 号峰来自青果， 11、 14 ～19 号峰来自虎杖， 7、 13 号峰来自莱菔子， 12 号峰来自青果和莱菔子， 见图2。

图1 13 批肝宝胶囊HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of thirteen batches of Ganbao Capsules

图2 各样品共有峰HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of common peaks of various samples

2.7 含有量测定

2.7.1 专属性试验 精密吸取对照品、 供试品、阴性样品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 结果见图3。 由图可知， 阴性样品在对照品相应保留时间处无色谱峰， 表明对测定无干扰， 方法专属性良好。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.2 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.3、0.9、 1.5、 2.1、 2.7、 3.3 mL， 置于25 mL 棕色量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 摇匀， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。 以进样量为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 得方程分别为没食子酸Y=1 201.9X-24 152 （r=0.999 4）、 芥子碱硫氰酸盐Y=1 329.9X-18 648 （r=0.999 6）、 虎杖苷Y=4 943.5X-385 062 （r=0.999 5）、 白藜芦醇Y=6 437.2X ＋7 355.9 （r = 0.999 6）、 大黄素Y =2 116.4X-10 507 （r=0.999 6）， 分别在45.19 ～497.05、 23.89 ～ 262.81、 194.26 ～ 2 136.81、4.45～48.95、 8.82 ～97.05 ng 范围内线性关系良好。

2.7.3 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次， 测得没食子酸、 芥子碱硫氰酸盐、 虎杖苷、 白藜芦醇、 大黄素峰面积RSD 分别为0.71%、 0.82%、 0.78%、0.98%、 0.93%， 表明仪器精密度良好。

2.7.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（编号S6）， 于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定， 测得没食子酸、 芥子碱硫氰酸盐、 虎杖苷、 白藜芦醇、 大黄素峰面积RSD分别为1.06%、 1.21%、 0.96%、 1.32%、 1.17%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7.5 重复性试验 精密称取胶囊内容物（编号S6） 6 份， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得没食子酸、 芥子碱硫氰酸盐、 虎杖苷、 白藜芦醇、 大黄素含有 量 RSD 分 别 为 1.17%、 1.58%、 1.22%、1.76%、 1.63%， 表明该方法重复性良好。

2.7.6 加样回收率试验 精密称取含有量已知的胶囊（编号S6） 9 份， 每份约0.17 g， 平均分成3组， 以80%、 100%、 120%水平分别精密加入对照品溶液[没食子酸（537.93 μg／mL） 0.60、 0.75、0.90 mL， 芥 子 碱 硫 氰 酸 盐 （284.43 μg／mL）0.69、 0.86、 1.03 mL， 虎杖苷（2 312.57 μg／mL）0.28、 0.35、 0.42 mL， 白藜芦醇（52.98 μg／mL）0.50、 0.62、 0.74 mL， 大黄素（105.03 μg／mL）0.72、 0.90、 1.08 mL］， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、 芥子碱硫氰酸盐、 虎杖苷、 白藜芦醇、 大黄素平均加样回收率分别为99.85%、99.46%、 99.97%、 98.95%、 99.67%， RSD 分别为1.56%、 1.98%、 1.42%、 2.13%、 2.01%。

2.7.7 样品含有量测定 取13 批胶囊， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算含有量， 结果见表1。

3 讨论

3.1 指标成分选择 肝宝胶囊中青果、 虎杖同为君药， 其中前者清热解毒， 利咽生津， 主要活性成分没食子酸具有明显保肝、 抗肝纤维化作用[7-10］，而后者利湿退黄， 清热解毒， 散瘀止痛， 止咳化痰， 主要活性成分虎杖苷、 白藜芦醇、 大黄素可对脂肪肝起到较好的改善作用[11-15］； 莱菔子为佐使药， 消食除胀， 降气化痰， 能调节脾胃之气机，芥子碱硫氰酸盐为其有效成分之一。 因此， 本实验选择没食子酸、 芥子碱硫氰酸盐、 虎杖苷、 白藜芦醇和大黄素作为肝宝胶囊含有量测定的指标成分。

表1 各成分含有量测定结果（n=3）Tab.1 Results of content determination of various constituents （n=3）

3.2 提取条件选择 本实验比较了不同提取溶剂（70%乙醇、 70%甲醇、 甲醇、 纯水）， 发现甲醇提取效果较优， 此时各成分响应较完全， 色谱基线稳定。 然后， 比较了不同提取方法（超声、 回流）及提取时间（20、 30、 40 min）， 发现甲醇超声提取30 min 时提取率较高， 可提取完全。

3.3 色谱条件选择 本实验比较了不同流动相（甲醇-0.1%磷酸、 乙腈-0.1%磷酸、 乙腈-3%冰醋酸、 乙腈-水）， 发现乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱时分离效果最好。 为了使各成分均有较好响应， 本实验比较了不同检测波长（254、 270、 305、 326 nm），发现在305 nm 处色谱峰较多， 峰形较好， 同时各成分均有吸收， 分离度理想。