达托霉素新杂质及其来源研究

夏兴 邵东 孙新强,*

(1 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司，上海 200240；2 浙江医药股份有限公司新昌制药厂，新昌 312500)

达托霉素是一种由13个氨基酸组成的新型脂肽类抗生素，是一种钙离子依赖型的抗生素。在钙离子存在的条件下，它将以非共价键的形式与细胞膜上达托霉素结合蛋白(DBPs)结合。达托霉素由微生物玫瑰孢链霉菌发酵生成的，具有在体外抗绝大多数的临床革兰阳性菌的作用，包括厌氧菌、肠球菌等耐药菌，且主要用于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等，在医学方面具有广阔的应用前景[1-2]。

达托霉素的化学结构复杂，结构如图1所示，其生产、纯化、运输、保藏环节的条件变化均会导致杂质的产生，影响产品质量和治疗效果。为评价药物的安全性、杂质的生物学影响，必须对相关杂质的结构进行确证。同时，在进行达托霉素申报注册时也需要说明相关杂质的来源，因此对相关杂质的研究十分重要。本文在研究达托霉素相关杂质过程中[3]，发现了一个未知杂质。通过高效液相分离纯化了该杂质，并进行UPLC-MS和NMR测定，推定了其结构。根据其化学结构，检测了生产原料，推测了其可能的来源。

1 仪器和试剂

Aglient 1100液相系统(美国Aglient)；质谱仪：ACQUITYTMUPLC & Q-TOF MS Premier(美国Waters)；核磁共振仪：Bruker Avance III 400MHz(德国Bruker)；GC-MS：安捷伦7890A-5975C(美国Aglient)。

达托霉素(浙江医药股份有限公司，批号：306DT150301)；癸酸：杭州油脂化工(批号：20170321009)；乙腈购于百灵威化学技术有限公司，色谱纯；硅烷化试剂购于上海安普科技；其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 HPLC分析方法

按照文献方法进行HPLC分析[4]。色谱柱：菲罗门C8，IB-SIL(4.6mm×250mm, 5μm) C8柱；柱温：25℃(22～28℃)；检测波长：214nm；流速：1.5mL/min；进样量：20μL。

流动相：A相0.45% NH4H2PO4中的20%乙腈，pH 3.25；B相0.45% NH4H2PO4中的50%乙腈，pH 3.25。目标流动相为35%乙腈于0.45% NH4H2PO4中，使得达托霉素的保留时间维持在(36.0±1.5)min，如有偏差，可通过调节A、B相，使保留时间在合理范围内。

溶液配制：精密量适量达托霉素样品，加A相和B相(1:1,V/V)流动相，制成含达托霉素1mg/mL。混匀，进行HPLC分析。

2.2 相关杂质的制备方法

利用HPLC对进行杂质制备，制备条件沿用HPLC分析条件。对达托霉素样品中各个杂质目标峰进行收集。收集的各个杂质溶液-18℃冷冻保存。等累计到一定量后，合并相同组分。减压薄膜浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥，获得含有杂质和盐的混合物。使用无水甲醇溶解含上述各个杂质的混合物，过滤去除不溶于甲醇的盐，获得的溶液进行减压浓缩，获得比较纯的杂质样品。

2.3 UPLC-MS分析方法

方法：ESI源，正离子。毛细管电压为3.0kV，锥孔电压35V，源内温度100℃，干燥气流温度250℃，干燥器流速400L/h; 碰撞能MS 6eV、MS-MS 35eV，质量扫描范围m/z80～2000，扫描时间1s，扫描间隔时间0.02s，样品浓度1mg/mL。

2.4 NMR检测方法

样品溶于0.5mL DMSO-d6中，进行核磁共振扫描。采用Bruke Avance III 400MHz配5mm BBOF探头，观察频率100MHz，扫描范围-20～220ppm，30度脉冲角，采样时间0.68s，延迟时间2s，扫描次数5120次，测定温度300K。

2.5 癸酸的GC-MS分析方法

癸酸样品，熔融后取100μL于气相顶空瓶中，加入900μL硅烷化试剂，封闭后70℃静置1h。进行GC-MS分析。

图1 达托霉素结构图Fig.1 The structure of daptomycin

G C-M S方法：色谱柱：D B-5(30m×0.25mm×0.25μm)；进样量：0.2μL；进样温度：270℃；分流比：100:1；载气：氦气(99.999%)；流量：1mL/min；柱温：40℃保持3min，以10℃/min升至300℃，保持8min；接口温度：270℃；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离方式：EI+，70ev；检测器电压：2200V；扫描方式：全扫描；质量范围：20～500；NIST 2014谱库。

3 实验结果

3.1 HPLC分析结果

所述的方法，对达托霉素进行了分析，发现达托霉素样品中杂质较多，主要含有10个杂质。HPLC图谱参见图2。针对这些杂质，进行了分离纯化。其中，保留时间30.1min(相对保留时间RRT为0.82)处的杂质为新杂质。

3.2 MS鉴定结果

采用全扫描一级质谱，并进一步对新杂质进行碰撞诱导解离实验，得到一级、二级质谱图，一级MS和二级MS见图3～4。

图2 达托霉素HPLC图Fig.2 HPLC profile of daptomycin

图3 新杂质MS图Fig.3 MS spectra of new impurity

按照文献[5]的方法，本研究进行新杂质MS-MS的解析。新杂质MS-MS片段模式如图5所示。正离子模式下，新杂质的[M+H]+准分子离子峰为m/z1618.6995，元素组成为C72H100N17O26；m/z809.8456为[M+2H]2+峰；m/z1280.51为杂质脱去脂肪酰基侧链和色氨酰的片段。其他主要的MS-MS数据参见表1。MS-MS显示，y1～y12的离子碎片与达托霉素的一致；b离子与达托霉素相比，碎片峰都比达托霉素的b离子小2。推测该化合物为在癸酰基侧链上形成双键。

3.3 NMR鉴定结果(表2，图6～7）

为进一步确证侧链结构，进行了核磁共振分析。13C NMR图谱参见图6；1H NMR图谱参见图7。核磁共振图谱的归属见表2。

图4 新杂质MS-MS图Fig.4 MS-MS spectra of new impurity

图5 新杂质结构和MS-MS片段模式Fig.5 Chemical structures of new impurity and its MS-MS fragmentation patterns

表1 新杂质的MS-MS序列数据分析Tab.1 Ions observed in MS-MS sequence analysis of new impurity

表2 13C NMR和1H NMR在DMSO-d6中数据Tab.2 1H NMR and 13C NMR Data for new impurity in DMSO-d6

图6 新杂质13C NMR图Fig.6 13C NMR spectra of new impurity

按照文献[5]的方法，我本研究进行新杂质核磁共振谱图的解析。相比达托霉素而言，在13C NMR上，于123.59和132.98ppm处有2个信号，属于烯键，同时在28ppm处，少了2个信号峰。结合1H NMR、推测在侧链的3,4位形成了双键。因此推测该杂质的结构，为N-(3-癸烯酰基)-L-色氨酰基-D-天冬酰胺酰基-L-天冬氨酰基-L-苏氨酰基-甘氨酰基-L-鸟氨酰基-L-天冬氨酰基-D-丙氨酰基-L-天冬氨酰基-甘氨酰基-D-丝氨酰基-苏-3甲基-L-谷氨酰基-L-3-邻氨基苯甲酰基-L-丙胺酸-ε1-内脂，其与达托霉素的主要区别在于侧链的3,4含有双键。

3.4 癸酸GC-MS分析结果(图8～9，表3)

采用ACD lab软件处理GC-MS数据。GC-MS的离子流参见图8。

图7 新杂质1H NMR图Fig.7 1H NMR spectra of new impurity

图8 硅烷化癸酸离子流图Fig.8 Ion flow spectra of silanized decanoic acid

在硅烷化癸酸的离子流图中，主要有3个离子峰。其中组分为硅烷化癸酸。在12.56min，有一个微量物质，其MS图参见图9。分子量显示，其比硅烷化癸酸少2Da，为硅烷化癸烯酸(表3)。

GC-MS结果显示，癸酸样品中主要成分为癸酸，主要杂质为辛酸、壬酸。并且在样品中发现癸烯酸。

GC-MS分析结果表明，杂质为发酵过程中补加癸酸时癸酸中含有少量的癸烯酸所致。因此，想要控制杂质，需在发酵过程中控制癸酸质量。

4 讨论

图9 硅烷化癸烯酸MS图Fig.9 MS spectra of silanized decenoic acid

表3 硅烷化癸酸样品主要成分Tab.3 Major component of silanized decanoic acid

肽类化合物结构复杂，由于之间为肽键相连，通过核磁分析很难确定连接关系。而质谱分析所形成的一系列碎片却对肽键连接顺序分析十分有效。Cubist曾经报道过一个分子量为1618的杂质，与我们分离到的新杂质分子量一致，但是Cubist并没有明确其结构[4,6]。本文在达托霉素研究的基础上，利用UPLC-MS和NMR分析了达托霉素新分离到的杂质。测试结果表明，该杂质与达托霉素的区别在于侧链上有烯键，进一步的研究结果表明，发酵原料癸酸中含有的微量癸烯酸是该杂质形成的可能原因。因此，认为在发酵过程中，控制起始原料癸酸的质量，可以控制该杂质的含量[7]。