HO-1对脓毒症大鼠血浆中HMGB-1表达的影响及其心肌保护机制

周仪华,袁 影,盛志勇,王 舒,王 萌,郭良云

(南昌大学第二附属医院：1.重症医学科；2.超声科,南昌 330006)

脓毒症性心肌损伤是脓毒症休克难以纠正，导致患者最终死亡的重要原因，血红素氧合酶-1(HO-1)对脓毒症心肌损伤具有保护作用[1]。经脂多糖(LPS)刺激后，有活力的心肌细胞通过TLR4/p13kγ信号通路分泌高迁移率族蛋白B-1(HMGB-1)，HMGB-1在LPS诱导的心脏收缩功能障碍中发挥重要作用[2]。在肺部、肠道等器官功能炎症损伤动物模型中，机体通过调节 HO-1及HMGB-1的释放而发挥器官功能的保护作用[3-4]。HO-1的心肌保护作用是否与HMGB-1的表达存在特定关系仍然不清楚。本研究通过盲肠结扎穿孔术(CLP)方法建立脓毒症大鼠心肌损伤模型，给予HO-1增强剂和抑制剂，检测脓毒症大鼠血浆中心肌损伤标志物和HMGB-1的表达，明确HO-1与HMGB-1是否存在特定关系，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级SD雄性大鼠128只(南昌大学江西医学院动物科学部提供)，体质量180～220 g。

1.2方法

1.2.1模型的建立 所有大鼠术前禁食12 h，采用异氟烷吸入麻醉法诱导和维持大鼠麻醉状态，用手术直剪于腹白线中点下方约0.3 cm处逐层剪开皮肤、肌层和腹膜，直视下探查腹腔，将盲肠末端取出并置于腹壁外，采用4号缝合线距盲肠末端1.6 cm 处结扎，结扎后用3号三棱针穿刺1孔，之后分别将盲肠回纳腹腔，4号缝合针逐层缝合关腹。术后3 h左右自由进食、饮水。观察大鼠活动、进食、竖毛、腹泻、眼球凹陷、呼吸等情况。

1.2.2实验分组 SPF级SD雄性大鼠128只，随机分为4组：假手术组、脓毒症组、钴原卟啉(Copp)Ⅸ组、锌原足啉(Znpp)Ⅸ组，每组32只。假手术组除不做CLP术外，其余操作均同脓毒症组；CoppⅨ组和ZnppⅨ组分别提前24 h给于HO-1增强剂CoppⅨ(10 mg/kg,腹腔注射)和抑制剂ZnppⅨ(10 mg/kg,腹腔注射)，以同样方法制作脓毒症模型。

1.2.3主要试剂及观察指标 HO-1增强剂CoppⅨ(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，HO-1抑制剂ZnppⅨ(美国Sigma公司)，10%水合氯醛溶液(上海强顺化工有限公司)，10%甲醛溶液(西陇化工股份有限公司)，HMGBl和HO-1抗体及相关二抗(美国Cell Signaling公司)。各组均于0、6、12、24 h处死大鼠8只，开腹经腹主动脉抽取全血5～6 mL,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血浆中CK-MB、cTnⅠ、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、HMGB-1水平，按试剂盒(美国Amersham公司)说明书进行操作。

1.2.4苏木素-伊红(HE)染色法观察心肌组织结构变化 取心脏组织，以10%甲醛溶液固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制备石蜡切片，超薄切片机切片，切片厚度5 μm，行常规HE染色。石蜡切片常规脱蜡水化，苏木素液染色，1%盐酸乙醇分化，返蓝，乙醇伊红染色，脱水，透明，中性树胶封片，选择横断心肌的切片放大200倍，显微镜下观察心肌组织病理结构变化情况。

1.2.5Western Blot检测HMGB-1和HO-1蛋白表达 提取心肌细胞总蛋白，取25 μg总蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、封闭，加入HMGB-1兔抗人单克隆抗体(1∶1 000)孵育,洗脱后加入辣根过氧化氢酶标记的二抗进行孵育，通过化学发光法检测蛋白条带,充分洗脱后添加显影液孵育，并于暗室中曝光。同样方法检测心肌细胞HO-1蛋白表达。

2 结 果

2.1术后各组实验动物一般情况观察 所有实验动物术后均很快苏醒，各组均出现心率、呼吸加快，精神反应差，部分呈嗜睡状态，饮食差，竖毛，腹泻等状态，少数出现出血或出血倾向。假手术组术后3 h左右恢复正常活动、进食、进水。脓毒症组在24 h死亡1只，ZnppⅨ组24 h死亡2只。

表1 各时间点血清H-FABP、HMGB-1及HO-1水平

续表1 各时间点血清H-FABP、HMGB-1以及HO-1水平

a：P<0.05，与脓毒症组同时间点比较；b：P<0.01，与CoppⅨ组同时间点相比较；c：P<0.05，与CoppⅨ组同时间点相比较；d：P<0.05，与脓毒症组同时间点比较；e：P<0.01，与CoppⅨ组同时间点相比较

2.2各时间点血浆CK-MB、cTnⅠ、H-FABP及HMGB-1表达水平变化 脓毒症组和ZnppⅨ组CK-MB、cTnⅠ升高，CoppⅨ组短暂升高后呈下降趋势，与脓毒症组和CoppⅨ组相比，ZnppⅨ组CK-MB、cTnⅠ升高明显(P<0.05)。除假手术组外，其余各组H-FABP均在6 h内升高，6 h后开始下降，与CoppⅨ 组相比，ZnppⅨ组升高明显(P<0.05)。假手术组HMGB-1表达水平无明显变化，其余各组HMGB-1表达水平均升高，其中ZnppⅨ组升高最明显，与脓毒症组和CoppⅨ 组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3HE染色法观察心肌组织结构变化 光镜下观察大鼠心脏的形态学变化：假手术组心肌结构清晰，胞核完整，心肌纤维排列整齐，横纹清晰，结构正常；脓毒症组可见心肌细胞水肿显著，核溶解、坏死；CoppⅨ组细胞肿胀、心肌纤维排列尚整齐，胞核完整，未见核溶解、坏死；ZnppⅨ组可见明显细胞肿胀，心肌纤维排列紊乱，核溶解坏死。见图1。

图1 HE染色光镜下心肌组织结构变化(×200)

2.4Western Blot检测心肌细胞HMGB-1及HO-1蛋白的表达 假手术组HMGB-1和HO-1蛋白的表达较弱，其余3组HMGB-1和HO-1蛋白均有不同程度的表达，其中ZnppⅨ组HMGB-1蛋白的表达最显著，与脓毒症组和CoppⅨ组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，差异有统计学意义(P<0.01)。CoppⅨ组HO-1蛋白的表达最显著，与脓毒症组和ZnppⅨ组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A:假手术组；B:脓毒症组；C:CoppⅨ组；D:ZnppⅨ组

图2 心肌细胞HMGB-1及HO-1蛋白的表达

3 讨 论

脓毒症时产生的多种细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6等，这些炎症因子可直接或间接损害心肌。这些细胞因子相互作用，可形成许多正反馈环，导致炎性反应持续加重，不仅可直接抑制心肌收缩功能，还参与心肌组织结构的破坏，增加心脏前负荷，破坏心肌钙稳态。HMGB-1是相对于TNF-α、IL-1等新的“晚期”炎症因子，是脓毒症致死效应的关键炎症介质，其表达水平与脓毒症严重程度及预后高度相关[1]。H-FABP主要存在心肌细胞胞质中，血液和其他组织中水平极低，因此在诊断心肌损伤方面具有较高的特异性；有研究显示，当心肌受损时参与心肌脂肪酸的摄入、运输和代谢的H-FABP会在心肌损伤时穿过细胞膜漏入血液中[5]。由于其相对分子质量小，在心肌受损情况下，可迅速穿过细胞膜漏入血管内，这在诊断心肌损伤方面具有较高的敏感性[6]。本研究通过CLP方法建立脓毒症大鼠模型，给予HO-1增强剂和抑制剂，检测脓毒症大鼠血浆中心肌损伤标志物和HMGB-1的表达。表1可以看出，假手术组各个时间点血浆中CK-MB、cTnⅠ、H-FABP无明显变化，而其余3组各指标在实验6 h内均有不同程度升高，从一定程度上证实脓毒症大鼠心肌损伤动物模型造模成功。

HO-1是一种细胞保护性蛋白，在炎性反应过程中可以抵抗各种有害刺激导致的机体损伤。目前已证实，在脓毒症心肌、肝脏、肺部等疾病的靶器官保护方面发挥重要作用[7-9]。从表1可以看出，ZnppⅨ组血浆中各心肌损伤标志物CK-MB、cTnⅠ、H-FABP均较CoppⅨ组明显升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。因为CoppⅨ是HO-1增强剂，而ZnppⅨ是HO-1抑制剂,因此，笔者推测在实验过程中CoppⅨ通过刺激HO-1的生成而发挥脓毒症心肌损伤的保护作用，这与上述多数研究所述的HO-1具有器官保护功能基本一致。同样，表1提示HMGB-1因子在ZnppⅨ组升高最明显，而在CoppⅨ 组的表达虽有升高，但明显低于CoppⅨ组，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。笔者推测在脓毒症心肌损伤动物模型中，HO-1与HMGB-1之间可能有某种特定的关联。

本研究结果表明，假手术组大鼠心脏组织细胞结构完整，未见明显心肌损伤，ZnppⅨ组心脏组织细胞严重破坏，脓毒症组次之，而CoppⅨ组心肌损伤明显较ZnppⅨ组和脓毒症组减轻，从心脏组织病理学角度证实在脓毒症心肌损伤过程中HO-1发挥着心脏保护作用。

另外，通过Western Blot方法检测损伤心肌HMGB-1及HO-1的表达，从细胞的角度探讨HMGB-1及HO-1在脓毒症心肌损伤过程中发挥的作用以及它们之间可能存在的关系。图2结果表明，假手术组HMGB-1和HO-1蛋白的表达均较弱，其余3组蛋白表达均有不同程度的增加。其中ZnppⅨ组HMGB-1蛋白的表达最显著，而CoppⅨ组该蛋白表达最弱，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；CoppⅨ组HO-1蛋白的表达最显著，而ZnppⅨ组该蛋白表达最弱，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

LI等[3]的研究发现在小鼠模型中氢气可以通过上调HO-1的合成抑制HMGB-1的表达，改善肺组织的炎性反应，并改善模型动物的死亡率。YU等[4]建立脓毒症大鼠肠功能损伤模型，给予氢气进行干预，研究发现，H2对野生型严重脓毒症大鼠肠功能损伤具有保护作用，其机制是通过调节 HO-1及HMGB-1的释放，减少氧化应激及炎症损伤，增加存活率。KIM等[10]的研究也证实在巨噬细胞系RAW264.7细胞中甘草皂苷可以通过上调H0-1的合成抑制LPS诱导的HMGB-1的表达。

本研究发现，HO-1和HMGB-1可能存在特定关系，即HO-1升高HMGB-1即下降，而HO-1下降，HMGB-1即明显升高。因此，笔者推测，HO-1可能通过抑制HMGB-1的表达而发挥脓毒症心肌保护作用。