盐酸小檗碱对2型糖尿病大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响

殷文贤，赵 萌，吴知桂，顾 立，陈美娟△

(1.西南医科大学附属中医医院药剂科，四川泸州 646000；2.西南医科大学药理学教研室，四川泸州 646000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)因其慢性并发症而具有较高致残、病死率。黄连治疗消渴病古有记载，盐酸小檗碱为黄连提纯物，主要用于胃肠道感染。近年发现盐酸小檗碱可用于T2DM治疗，机制涉及降压、降脂、减重、抗血小板聚集、胰岛素增敏等[1-3]，但尚少见盐酸小檗碱对T2DM模型动物血管平滑肌的作用报道。故本研究拟通过观察不同浓度盐酸小檗碱对T2DM大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、迁移及转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的影响，探讨其对T2DM大鼠VSMCs的保护作用及可能机制，为小檗碱用于T2DM并发症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1试验药物 盐酸小檗碱，中国食品药品检定研究院提供，黄色粉末，批号115-53-7；卡托普利(汕头金石制药厂)，批号091023；链脲佐菌素(美国Sigma公司)，批号S0130。

1.2动物 30只体质量(200±20)g的6～7周龄健康雄性SD大鼠，购自西南医科大学实验动物中心，Ⅰ级动物，合格证号：川实动字第017号。实验经西南医科大学动物实验伦理委员会批准(2016-021)。

1.3试剂 胰蛋白酶，美国Sigma公司；DMEM/F12培养基，美国Gibco公司；CCK-8，碧云天生物技术研究所；Transwell小室，北京Vigorous公司；TGF-β1 ELISA试剂盒，上海蓝基生物科技有限公司；胰岛素放疫试剂盒，北京普尔伟业生物科技有限公司。

1.4仪器 倒置相差显微镜，日本Olympus公司；CO2培养箱，日本Sanyo公司；一次性6、24、96孔培养板(美国Corning公司)；酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)。

1.5方法

1.5.1T2DM模型的构建 大鼠适应性喂养1周后，随机选取20只造模，高糖高脂饲料(蔗糖20.0 g，猪油10.0 g，胆固醇2.5 g，胆酸盐1.0 g，常规饲料66.5 g)喂养2个月，1个月时腹腔注射链脲佐菌素25 mg/kg；另10只为正常组，常规饮食喂养2个月，1个月时腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。两组实验同时进行。2个月后进行评价，以空腹血糖大于7.0 mmol/L、餐后2 h血糖大于11.1 mmol/L且伴有胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)下降(P<0.05)的判定为造模成功，ISI=ln[1/(Ins×FPG)]。

1.5.2VSMCs培养及分组 分别将正常鼠和T2DM模型鼠脱颈处死后，迅速取出胸主动脉，除去结缔组织并刮去内膜后剪成1 mm×l mm×l mm左右的组织小块，放入加了3 mL DMEM培养基(含20%胎牛血清)的培养瓶，在CO2培养箱(37 ℃、5%CO2)内进行原代培养并完成传代。分别选取鉴定后的形态良好、生长旺盛的4～6代对数生长期的传代细胞备用。正常组为正常大鼠的VSMCs；T2DM模型大鼠的VSMCs分别用于模型组、阳性对照组、治疗组1～5。

1.5.3细胞增殖实验 将正常鼠和T2DM模型鼠的VSMCs悬液细胞浓度均调整至1×105/mL，接种于96孔板中，90 μL每孔，8个组每组5个复孔，正常加90 μL含10%血清的DMEM培养基。CO2培养箱(37 ℃、5%CO2)中培养24 h后，空白组、模型组和正常组每孔各加10 μL无血清DMEM，阳性对照组加50 μg/mL的卡托普利10 μL，治疗组1～5加100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的盐酸小檗碱各10 μL[4]，放CO2培养箱中培养48 h。48 h后，每孔加入CCK-8 10 μL，培养1 h后在450 nm波长下酶标仪检测各孔的吸光度A值。细胞增殖抑制率=[1-(A加药-A空白孔)/(A不加药-A空白孔)]×100%。

1.5.4细胞迁移实验 选用二十四孔培养板放入Transwell小室，上室加入细胞浓度调整为2.0×105/mL的无血清DMEM培养基200 μL，下室治疗1～5组依次加入浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg /mL的盐酸小檗碱样品各60 μL，阳性对照组加50 μg/mL的卡托普利60 μL,正常组加等体积无血清DMEM培养基，CO2培养箱(37 ℃、5%CO2)孵育48 h，从小室取出后擦去上室滤膜内表面及基质胶残存的细胞，然后用PBS液清洗迁移到滤膜外表面的细胞，固定、染色后，置镜下随机选5个高倍视野，记录膜上细胞总数目。重复3次，取平均值。

1.5.5双抗体夹心ELISA测定TGF-β1水平 将细胞浓度均调整为1×105/mL，分别接种于96孔板中，分组、加药方法同1.5.3。CO2培养箱(37 ℃、5%CO2)培养48 h后用无菌管收集细胞悬液，3 000 r/min离心20 min，取上清液。每孔所得上清液均分为3份，分别将各组上清液加入反应孔中，洗涤后加入生物素化的抗大鼠TGF-β1抗体孵育60 min，然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，孵育30 min后加入显色剂37 ℃避光显色15～20 min，随后加入终止液，混匀后5 min内测量A值，通过绘制标准曲线求出TGF-β1水平。上述各步骤加入的试剂均为100 μL/孔。

2 结 果

2.1T2DM大鼠模型的建立 模型大鼠经高糖高脂喂养2个月+腹腔注射链脲佐菌素后，食量、饮水量、尿量增加明显，活动减少，体质量较正常组明显降低(P<0.01)；与正常组比较，血糖(空腹、餐后2 h)、血胰岛素明显增加(P<0.01)，ISI明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠体质量、血糖、胰岛素敏感指数比较

*：P<0.05，#：P<0.01，与正常组比较

2.2VSMCs鉴定

2.2.1形态学 正常大鼠VSMCs需6～8 d由组织块中爬出，需20 d铺满培养瓶。显微镜下细胞呈细扇形、梭形、三角形或不规则形，胞质密度高，胞浆丰富，不透明，有多个细胞突起，核卵圆居中，有多个核仁。细胞生长致密平行排列成束状，重叠生长区域呈“峰-谷”状。T2DM大鼠VSMCs需3～4 d就能从组织块中爬出，只需8～12 d铺满培养瓶。细胞形态、胞浆、胞质、胞核均与正常大鼠VSMCs相似，但细胞生长更为致密，重叠生长成束、成网、呈旋涡状。见图1。

A:正常大鼠VSMCs排列呈“峰-谷”状;B:T2DM大鼠VSMCs排列呈旋涡状

图1 倒置相差显微镜下正常大鼠及糖尿病大鼠VSMCs(×100)

2.2.2生长曲线 VSMCs生长曲线近似“s”形，前3 d增殖旺盛，呈对数生长，3～5 d生长速度减慢，5～7 d后细胞逐渐死亡。T2DM大鼠胸主动脉VSMCs生长速度明显快于正常组，呈异常增殖状态。见图2。

图2 正常组和模型组大鼠VSMCs生长曲线

2.2.3SM α-actin鉴定 大鼠VSMCs的胞浆经α-actin特异性染色呈棕黄色，胞核苏木素染呈蓝色，低倍镜下见细胞大小不等、形态各异(长梭形、扇形、三角形及不规则形)；高倍镜下胞浆内见大量棕黄色、与细胞长轴平行的α-actin。模型组与正常组细胞比较胞浆棕黄色更深，同一视野下细胞数更多。见图3。

A:正常组;B:T2DM

图3 大鼠VSMCs的SM α-actin鉴定(×400)

2.3不同浓度盐酸小檗碱对T2DM大鼠VSMCs增殖的影响 不同浓度盐酸小檗碱对正常组大鼠和T2DM大鼠VSMCs的增殖均可产生抑制作用，抑制强度与浓度呈正相关。见图4。

图4 不同浓度盐酸小檗碱对正常组和模型组VSMCs增殖的抑制率曲线

与正常组比较，模型组大鼠VSMCs增殖显著增强(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组及阳性对照组均VSMCs增殖明显受抑制(P<0.01)；各治疗组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，治疗组1、2的抑制作用较强(P<0.01),治疗组3则与之相当(P>0.05)，治疗组4相对较弱(P<0.05)。见表2。

2.4不同浓度盐酸小檗碱对T2DM大鼠VSMCs迁移的影响 模型组穿膜细胞数较正常组明显增加(P<0.01)；各治疗组穿膜细胞数均少于模型组(P<0.01)，盐酸小檗碱各组穿膜细胞数均减少，且与浓度呈负相关(P<0.01)；治疗组1穿膜细胞数明显小于阳性对照组(P<0.01)，治疗组3～5对糖尿病VSMCs迁移的抑制作用不及阳性对照组(P<0.05)。见表2。

表2 盐酸小檗碱对T2DM大鼠VSMCs增殖、迁移、TGF-β1水平的影响

a：P<0.05，aa：P<0.01，与正常组比较；b：P<0.01，与模型组比较；c：P<0.01，与阳性对照组比较；d：P<0.05，与治疗组1比较；e：P<0.05，与治疗组2比较；f：P<0.05，与治疗组3比较

2.5不同浓度盐酸小檗碱对T2DM大鼠VSMCs培养液中TGF-β1水平的影响 与正常组相比，模型组TGF-β1水平明显增高(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组及治疗组1～4 TGF-β1水平均较低(P<0.05)，治疗组5差异无统计学意义(P>0.05)。与阳性对照组相比，治疗组1、2 TGF-β1水平较低(P<0.05)，治疗组3～5与之差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨 论

T2DM的慢性并发症(如糖尿病肾病、视网膜病、外周血管及冠脉动脉粥样硬化)是其致残致死的主要原因，其病变基础多为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)。VSMCs的过度增殖、迁移及表型转变作为AS进程的关键因素，而成为T2DM慢性并发症的发病基础。TGF-β1是调控VSMCs增殖凋亡平衡的重要细胞因子，能诱使细胞外基质沉积和成分改变，促进细胞生长、迁移。研究发现干预TGF-β1能从基因水平抑制P-53和c-jun的表达，从而延缓T2DM大血管病变[5-6]。

《血管紧张素转换酶抑制剂在冠心病患者中应用中国专家共识》[7]建议，卡托普利适用于所有确诊的冠心病或其他AS患者。也有研究发现卡托普利能调节VSMCs增殖、凋亡因子表达[8]，故本实验选用卡托普利作为阳性对照。本研究结果发现，盐酸小檗碱可减少T2DM大鼠VSMCs增殖与迁移，作用强度与其浓度呈正相关，与LEE等[9]发现小檗碱能抑制大鼠VSMCs增殖的结果一致，且100 μg/mL盐酸小檗碱的作用明显强于卡托普利(P<0.01)。结果提示盐酸小檗碱从抑制VSMCs的增殖迁移来防治T2DM并发症可能是有效的；实验进一步发现盐酸小檗碱能显著降低T2DM大鼠VSMCs中TGF-β1水平，盐酸小檗碱100、50 μg/mL组效果优于阳性对照组(P<0.01)，提示盐酸小檗碱抑制T2DM大鼠VSMCs增殖迁移可能与下调TGF-β1水平有关。Smad依赖性信号通路是TGF-β1诱导纤维化的最经典的信号通路[10]，其通过Smads蛋白将信号由细胞外传导到细胞内，在细胞水平发挥诱导细胞凋亡、促进新生血管形成、调控细胞迁移、调节细胞周期等作用。盐酸小檗碱下调TGF-β1是否通过该通路或是通过其他通路[11](如P38MAPK通路、SGK1通路、Notch、Wnt等)有待进一步研究。

综上所述，盐酸小檗碱对T2DM大鼠VSMCs有明显抑制增殖、迁移的作用，该作用可能与降低TGF-β1水平有关。抑制作用随盐酸小檗碱浓度增加而增强，高浓度盐酸小檗碱(>50 μg/mL)的作用强于卡托普利，该发现为盐酸小檗碱用于T2DM并发症治疗提供了新的实验依据。