用siRNA研究IQGAP1基因调控STAT3信号对脑胶质瘤细胞生物学特性的影响*

张广华，巨 虎，许常林，肖宗宇△，苑 乐

(青海大学附属医院1神经外科，2教学管理部，青海 西宁 810001)

脑胶质瘤是常见的一种中枢神经系统原发性恶性肿瘤，具有增殖无控性、易侵袭生长和易复发的特点，预后较差，5年生存率很低[1]。大量研究表明，脑胶质瘤的发生发展本质上是多种基因表达异常，如抑癌基因的缺失或突变及原癌基因的表达过度，使肿瘤细胞能够逃避正常生长调控机制[2]。因此，研究脑胶质瘤中异常表达基因生物特性及机制具有重要意义。含IQ模体的GTP酶激活蛋白1(IQ motif-containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1)是一种进化保守的多结构域蛋白。近年来的研究表明，在肺癌、肝癌和结直肠癌等多种肿瘤中均可检测到IQGAP1的高表达，为一个原癌基因[3-5]。已有研究证实，下调IQGAP1表达可抑制脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力[6-7]。STAT3是信号转导及转录激活因子(signal transducters and activators of transcription，STATs)家族成员之一，在多种肿瘤中被激活，其基因已被定义为癌基因[8]。有研究表明，抑制STAT3信号可降低肿瘤细胞生长及免疫抑制[9-10]。IQGAP1是否可调控STAT3信号影响脑胶质瘤细胞生物学特性目前尚未明确。因此，本研究旨在探讨沉默IQGAP1是否可通过调控STAT3信号影响脑胶质瘤细胞侵袭、迁移和免疫抑制相关因子的表达。

材 料 和 方 法

1 细胞株

人脑胶质瘤U251细胞购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。细胞在含有10% FBS、青霉素(1×105U/L)和链霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5%体积分数CO2培养箱中培养。细胞达85%左右生长融合时，用胰酶消化后传代。

2 试剂和仪器

RPMI-1640培养基、FBS、青霉素和链霉素均购自Gibco；抗IQGAP1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、STAT3和p-STAT3抗体均购自Abcam ；MTT、DMSO和AG490均购自Sigma；Transwell小室试剂盒和Matrigel均购自Corning；脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen。凝胶成像仪购自美国Bio-Rad；倒置显微镜购自OLYMPUS。

3 方法

3.1小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列构建及细胞转染 实验分为空白(blank)组、阴性对照(negative control,NC)组和si-IQGAP1组。依据GenBank中提供的IQGAP1CDS序列，根据siRNA设计原则设计IQGAP1的干扰序列及阴性对照序列，由上海吉玛合成。序列如下：si-IQGAP1-1： 5’-GGCACAUGCAGAGAAUAAUTT-3’; si-IQGAP1-2： 5’-GCCC ACUUAAGCAUCAUUATT-3’; IQGAP1-NC: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。转染前1 d，以5×107/L接种生长至对数期的U251细胞于6孔板，每孔2 mL，待细胞达70%融合率时，将依据阳离子脂质体LipofectamineTM2000说明制备的siRNA-LipofectamineTM2000复合物加入6孔板，空白组仅加阳离子脂质体，轻摇混匀，培养箱内常规孵育6 h，弃去孔内含siRNA的转染试剂，更换为新鲜的培养基，继续培养48 h。Western blot检测转染后的细胞中IQGAP1的蛋白表达。

3.2MTT法检测细胞活力 取生长状态良好的U251细胞，以每孔5×103接种于96孔板，37 ℃、5% CO2培养箱常规孵育过夜，转染siRNA，转染后48 h，每孔细胞加MTT 20 μL，37 ℃培养箱常规孵育4 h，吸去培养上清，每孔加DMSO 200 μL，摇床低速震荡10 min，酶标仪测定490 nm的吸光度值(A值)。实验重复3次，取均值。

3.3Western blot检测IQGAP1蛋白的表达 收集转染后48 h的细胞，加适量RIPA裂解液在冰上裂解反应30 min，转移细胞至离心管，离心后取上清，BCA试剂盒检测上清中蛋白浓度。取40 μg蛋白上样，依次经10% SDS-PAGE分离、转NC膜及5%脱脂奶粉封闭，加抗IQGAP1(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜，加HRP标记的兔抗鼠 II 抗(稀释比例1 ∶3 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL显影。ImageJ软件分析条带灰度值。以目的蛋白与内参照蛋白条带灰度值比值为相对表达量。实验重复3次。参照上述方法检测VEGF、TGF-β1及STAT3信号通路中STAT3和p-STAT3的蛋白水平。

3.4细胞迁移和侵袭能力的检测 实验分组同3.1。Transwell小室的上室中铺入60 μL稀释好的Matrigel(Matrigel与培养液比例为1∶3)，37 ℃条件孵育4～5 h以使其聚合成凝胶。收集转染siRNA 48 h的细胞，无血清培养液制备成单细胞悬液，以每孔1×105cells浓度每孔200 μL加入到Transwell小室的上室。Transwell小室的下室中加入600 μL含10% FBS的培养液，37 ℃孵箱中常规孵育24 h。轻轻擦掉Transwell小室面上未穿过膜的细胞，4%多聚甲醛在室温条件下固定30 min，苏木精-伊红染色20 min，光学显微镜下(×400)随机选择5个视野(包括上、中、下、左和右)，计算穿过膜的细胞数，取均值。实验重复3次。细胞侵袭能力的检测除了未铺Matrigel，其它方法同上。

抑制STAT3信号后细胞侵袭和迁移能力检测分为3个处理组，即空白组(细胞不经特殊处理)、AG490组(50 μmol/L的STAT3信号抑制剂AG490处理细胞)和AG490+si-IQGAP1组(50 μmol/L AG490及si-IQGAP1同时处理细胞)。各组细胞处理48 h，参照上述方法检测细胞侵袭和迁移能力。并用Western blot检测相关蛋白的表达。

4 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 IQGAP1在脑胶质瘤U251细胞表达

IQGAP1 siRNA转染人脑胶质瘤U251细胞后，Western blot检测转染效果，结果显示，si-IQGAP1-1组和si-IQGAP1-2组IQGAP1蛋白表达均显著低于空白组(P<0.05)，NC组 IQGAP1蛋白表达与空白组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

Figure 1. Western blot was used for determining the protein expression of IQGAP1. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

图1 Western blot检测IQGAP1在脑胶质瘤细胞表达水平

2 敲减IQGAP1表达抑制U251细胞活力及侵袭和迁移能力

分别采用MTT法和Transwell小室检测各组细胞活力及侵袭和迁移能力，结果显示，与空白组比较，si-IQGAP1组的细胞活力及侵袭和迁移能力均明显降低(P<0.05 )，见图2。

3 敲减IQGAP1表达对U251细胞免疫抑制相关蛋白表达的影响

Western blot检测各组细胞免疫抑制相关的VEGF和TGF-β1蛋白表达，结果显示，与空白组比较，si-IQGAP1组VEGF和TGF-β1的蛋白表达均明显降低(P<0.05)，见图3。

4 敲减IQGAP1表达下调U251细胞STAT3信号通路相关分子的蛋白水平

与空白组比较，si-IQGAP1组p-STAT3蛋白表达明显降低(P<0.05)，3组间STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

5 敲减IQGAP1表达增加AG490对U251细胞活力、侵袭和迁移的抑制

用STAT3信号通路抑制剂AG490和si-IQGAP1+AG490处理U251细胞，细胞侵袭及迁移能力检测结果显示，AG490组细胞侵袭和迁移能力均显著低于空白组，而si-IQGAP1+AG490组细胞侵袭和迁移能力显著低于AG490组(P<0.05)，见图5。

6 沉默IQGAP1表达加强AG490对U251细胞的免疫抑制效应

AG490组的VEGF和TGF-β1蛋白表达显著低于空白组，而si-IQGAP1+AG490组的VEGF和TGF-β1蛋白表达均显著低于AG490组(P<0.05)，见图6。

讨 论

IQGAP1基因在人体组织中有广泛表达，尤其在细胞迁徙、细胞黏附、胞质分裂和胞外信号等细胞进程中发挥重要作用[11]。研究表明，IQGAP1蛋白与多种重要的生物学过程相关，对多种肿瘤发生发展起促进作用[12]。而也有研究指出，下调IQGAP1表达可抑制肿瘤细胞生长，如过表达IQGAP1可增强乳腺癌细胞增殖能力，而敲减IQGAP1表达可抑制细胞的侵袭和迁移能力[13]；敲减IQGAP1表达可降低肝癌细胞的侵袭能力，并诱导细胞凋亡[14]。

Figure 2. The effect ofIQGAP1expression knock-down on the viability (A), invasion (B) and migration (C) of U251 cells (×400). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

图2 沉默IQGAP1表达对U251细胞活力及侵袭和迁移能力的影响

Figure 3.Western blot was used for determining the effect ofIQGAP1expression knock-down on the protein expression of VEGF and TGF-β1 in the U251 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

图3 沉默IQGAP1表达下调U251细胞VEGF和TGF-β1表达

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是常见的在转录后阻断基因表达的一种新技术，因其能高效性、特异性的抑制目的基因表达，目前在基因功能研究和基因治疗等方面有广泛的应用[15-16]。本研究中使用RNAi技术敲减U251细胞IQGAP1的表达，发现IQGAP1表达的抑制可使脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力明显降低。这与前人研究结果一致[6-7]。

STAT是一条可广泛作用于肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学过程的信号途径，STAT3是STAT家族的一个重要成员，被激活后可转变为磷酸化的STAT3，可通过诱导细胞增殖、侵袭和迁移及抑制凋亡而参与肿瘤发生发展[17-18]。多种肿瘤中STAT3信号异常激活，其激活与肿瘤进展及预后密切相关[19]。研究发现，胶质瘤中STAT3信号也处于激活状态，而下调STAT3信号可降低胶质瘤细胞的生长，AG490为STAT3信号抑制剂，有研究显示，AG490可抑制脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡[20-21]。本研究结果显示，沉默IQGAP1表达可降低p-STAT3的蛋白水平；AG490可增强敲减IQGAP1对脑胶质瘤细胞侵袭和迁移的抑制作用。本研究结果提示，敲减IQGAP1的表达可通过下调STAT3信号抑制脑胶质瘤细胞活力、侵袭和迁移能力。

Figure 4.Western blot was used for determining the effect ofIQGAP1expression knock-down on the protein levels of STAT3 and p-STAT3 in the U251 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group.

图4 敲减IQGAP1表达对U251细胞STAT3信号通路的影响

Figure 5.Knock-down ofIQGAP1expression increased the inhibitory effect of AG490 on the viability (A), invasion (B) and migration (C) of U251 cells (×400). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsAG490 group.

图5 敲减IQGAP1表达增加AG490对U251细胞活力及侵袭和迁移能力的抑制作用

Figure 6.Knock-down ofIQGAP1expression promoted the inhi-bitory effect of AG490 on the protein expression of VEGF and TGF-β1 in the U251 cells (determined by Western blot). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsAG490 group.

图6 敲减IQGAP1表达加强AG490抑制U251细胞表达VEGF和TGF-β1的效应

有研究表明，免疫抑制因子在肿瘤细胞、肿瘤患者血清及组织提取液中广泛存在，能够直接诱导免疫逃逸、抑制宿主的抗肿瘤免疫力，进而促进肿瘤生长、侵袭和转移[22]。近期已发现一些免疫因子如VEGF、TGF-β和IL-10等可主动抑制机体的免疫反应[23]。VEGF是一个具有多功能的细胞因子，可提高毛细血管通透性、诱导血管生成等，在肿瘤生长中起重要作用[24]。TGF-β是目前研究较多，也较肯定的一个免疫抑制因子，在肿瘤进展期可抑制免疫系统对肿瘤细胞杀伤，并增加血管生成，刺激细胞外基质产生，进而促进肿瘤细胞的侵袭及转移[25]。有研究表明，抑制STAT3信号可降低VEGF和TGF-β的表达[26-27]。本研究结果显示，敲减IQGAP1可下调VEGF和TGF-β1的表达，并增强AG490对VEGF和TGF-β1表达的抑制效应，提示敲减IQGAP1可能通过下调STAT3信号影响对脑胶质瘤的免疫反应。

由此可见，敲减IQGAP1基因的表达可抑制脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力，下调细胞免疫抑制因子VEGF和TGF-β1的表达，机制可能与STAT3信号的下调有关。这提示IQGAP1可能是脑胶质瘤基因治疗的有效靶点。后续研究将致力于IQGAP1对脑胶质瘤细胞其他生物学特性及机制的研究。