lincRNA-p21通过STAT3信号抑制结直肠癌HCT116细胞增殖*

朱克祥，张正聪，袁得峰，吕鹏飞，白小平

(兰州大学第一医院1普外二科,2东岗院区普外科,3甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室，甘肃 兰州 730000)

结直肠癌是发生于消化道结肠和直肠部位的恶性肿瘤，在消化系统恶性肿瘤中其发病率和病死率较高[1-2]。随着人们生活习惯的改变及环境的变化，结直肠癌发生率每年都有不同程度的增加趋势[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类核苷酸长度超过200 bp、不编码蛋白质、对基因表达具有调控作用的RNA分子[4-5]。研究显示，lncRNA的异常表达与一些肿瘤的发生与发展密切相关。在结直肠癌形成的过程中，lncRNA的表达表现出异常，在肿瘤组织中的表达与癌旁组织相比一些lncRNA表现为下调，另外一些lncRNA表现为上调[6]。最近研究发现，在结直肠癌组织中基因间区长链非编码RNA-p21(long intergenic non-coding RNA-p21,lincRNA-p21)的表达量显著降低，提示lincRNA-p21在结直肠癌中起到抑癌作用，是一种抑癌性lncRNA[7]。信号转导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一类转录因子，受上游激酶激活后可调控细胞增殖、凋亡和迁移等过程[8-9]。STAT3是STAT家族成员之一，磷酸化的STAT3进入到细胞核内，启动基因转录，最终导致细胞增殖和转移[10]。研究表明STAT3信号转导通路参与调控结直肠癌细胞的发生、发展、增殖和凋亡抑制等过程[11]。lincRNA-p21可通过调控多种信号通路参与多种肿瘤细胞的生物学过程，目前未见关于lincRNA-p21对结直肠癌作用及分子机制的研究，因此本实验通过体外培养人结直肠癌细胞株HCT116，探讨lincRNA-p21对结直肠癌细胞生长的影响并对其是否通过调控STAT3信号通路实现该功能进行初步探讨，以期为结直肠癌的治疗及预后提供分子治疗靶点。

材 料 和 方 法

1 材料

人结直肠癌细胞株HCT116购于上海中科院细胞研究所。胶原酶、胰蛋白酶、DMEM培养基和胎牛血清均购自Sigma；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen；pcDNA-lincRNA-p21和pcDNA3.1 control购自CST；MMLV逆转录试剂盒购自Promega；TRIzol提取RNA试剂盒购于武汉艾美捷公司；SYBR Green Gene Expression Assay购自大连宝生物公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购于江苏凯基生物公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自Thermo；ECL发光试剂盒购自Bio-Rad；MTT购自广州朗日生物公司；抗STAT3抗体和抗p-STAT3抗体购自Abcam；辣根过氧化物标记的 II 抗购于碧云天生物科技公司；实验所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1细胞转染及分组 取生长对数期的HCT116细胞，按照每孔105个接种于6孔细胞培养板中，当细胞汇合度达到70%时，将pcDNA-lincRNA-p21和pcDNA3.1 control分别转染细胞，分别记为pcDNA-lincRNA-p21组和pcDNA组;以不做任何处理的HCT116细胞为正常对照(control)组。按照转染试剂说明书用Lipofectamine 2000进行转染，于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。24 h后更换为新的RPMI-1640培养液，37 ℃继续培养。

2.2RT-qPCR测定lincRNA-p21的表达水平 各组细胞培养48 h后，按照TRIzo1提取RNA试剂盒说明书提取细胞总RNA、RNA经浓度和纯度检测后用MMLV逆转录试剂盒进行合成cDNA。用SYBR Green Gene Expression Assay试剂盒进行荧光定量PCR扩增，反应体系为20 μL(cDNA模板4 μL，SYBR Green 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DEPC-H2O 4 μL)，反应条件为： 95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40个循环。以GAPDH为内参照，用相对定量2-ΔΔCt法分析lincRNA-p21的表达水平。GAPDH的上游引物序列为5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物序列为5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’; lincRNA-p21的上游引物序列为5’-CCCGGGC-TTGTCTTTTGTT-3’，下游引物序列为5’-GAGTGGGTGGCTCACTCTTCTG-3’。

2.3MTT测定结直肠癌细胞的活力 将各组细胞接种到96孔板中，每个组设置5个重复孔。分别于培养24 h、48 h、72 h和96 h后，将浓度为0.5 g/L的MTT 20 μL加入到每孔细胞中，将细胞放置在37 ℃的培养箱中继续孵育4 h；取出细胞培养板，去掉上清后，在每个孔中依次添加100 μL的DMSO溶液，置于振荡仪上缓慢摇动反应10 min，于酶标仪上测定每孔570 nm波长处的吸光度(A)值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制HCT116细胞的生长曲线。

2.4平板集落形成实验检测细胞集落形成的能力 取各组细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液制备成细胞悬液，每组细胞分别以每个培养皿50、100和200个细胞接种到含10 mL培养液的培养皿中。置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2周以后，肉眼观察到培养皿中形成的细胞集落时，把培养液移除，用PBS小心洗涤2次，加入5 mL 4 %的多聚甲醛固定细胞15 min。去除固定液后用吉姆萨染色液染20 min，然后用流水冲洗掉染液，于空气中干燥。将平皿倒置，肉眼直接计数细胞集落数。集落形成率(%)=细胞集落数目/细胞总数×100 %。

2.5Western blot检测STAT3和p-STAT3的蛋白水平 采用胰蛋白酶消化法收集转染48 h后各组细胞，用预冷的PBS洗涤细胞3次，置于冰上加入细胞裂解液，4 ℃离心，收集上清，采用BCA法测定提取上清中蛋白浓度。取蛋白样品加入等体积上样缓冲液混合后煮沸5 min，使蛋白样品充分变性。每个泳道加20 μL变性的蛋白样品，采用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行电泳，以90 V的低压在浓缩胶中进行电泳，以120 V的电压在分离胶中电泳。电泳结束后取出凝胶，放入电转膜液中以300 mA恒流进行转膜，转膜2 h。转膜结束后用洗液将PVDF膜洗涤15 min，之后把PVDF膜放在用TBST稀释的牛血清白蛋白中室温封闭 2 h。加入300倍稀释的 I 抗4 ℃反应过夜，加入1 000倍稀释的 II 抗室温孵育2 h。用ECL显色试剂盒进行显色，用凝胶成像仪进行拍照，以GAPDH为内参照，分析蛋白表达水平。

2.6STAT3激活剂对上调lincRNA-p21后HCT116细胞活力的影响 以8 μmol/L的STAT3激活剂SD19处理未经任何处理的及转染pcDNA-lincRNA-p21后的HCT116细胞，分别记为SD19组和pcDNA-lincRNA-p21+SD19组。处理48 h后用MTT法检测control组、pcDNA-lincRNA-p21组、pcDNA-lincRNA-p21+SD19组和SD19组的细胞活力变化，方法同2.3。Western blot法检测细胞中STAT3和p-STAT3的蛋白水平，步骤同2.5。

2.7流式细胞术检测结直肠癌细胞的凋亡情况 收集处理48 h后的各组细胞，用预冷的PBS对细胞进行洗涤3次，在细胞中加入400 μL的Binding Buffer结合缓冲液进行混合，再依次加入10 μL PI 和5 μL Annexin V-FITC，室温下避光反应5 min，用流式细胞术检测各组HCT116细胞的凋亡情况。

3 统计学分析

实验所得数据用SPSS 21.0软件进行统计分析。数据均以均数±标准差(mean±SD)表示。用单因素方差分析进行多组间差异比较，用SNK-q检验进行多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 转染后HCT116细胞中lincRNA-p21的表达

与control组和pcDNA组相比，pcDNA-lincRNA-p21组细胞中lincRNA-p21的表达水平显著升高(P<0.05)；与control组相比，pcDNA组细胞中lincRNA-p21的表达水平无明显变化，见图1。这说明转染pcDNA-lincRNA-p21的HCT116细胞中lincRNA-p21的表达水平升高。

Figure 1.The expression level of lincRNA-p21 in HCT116 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

图1 各组HCT116细胞中lincRNA-p21水平

2 过表达lincRNA-p21对STAT3和p-STAT3蛋白水平的影响

与control组和pcDNA组相比，pcDNA-lincRNA-p21组中STAT3和p-STAT3的蛋白水平明显降低(P<0.05)；与control组相比，pcDNA组中STAT3和p-STAT3蛋白水平的差异无统计学显著性，见图2。这说明过表达lincRNA-p21可抑制STAT3和p-STAT3的蛋白水平，抑制STAT3信号通路的激活。

3 pcDNA-lincRNA-p21可抑制HCT116细胞的生长

过表达lincRNA-p21后，采用MTT法检测各组HCT116细胞的活力，结果显示，与control组和pcDNA组相比，pcDNA-lincRNA-p21组细胞的A值下降(P<0.05);与control组相比，pcDNA组细胞A值的差异无统计学显著性，见图3。检测HCT116细胞集落形成能力结果显示，control组、pcDNA组和pcDNA-lincRNA-p21组细胞集落形成率分别为(41.11±4.05)%、(39.95±4.11)%和(19.11±2.24)%；与control组相比，pcDNA-lincRNA-p21组的细胞集落形成率明显降低(P<0.05)，pcDNA组的细胞集落形成率的差异无统计学显著性，见图4。这些结果提示过表达lincRNA-p21可降低结直肠癌细胞增殖能力。

Figure 2.The protein levels of STAT3 and p-STAT3 in the HCT116 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

图2 各组HCT116细胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平的变化

Figure 3.The effect of transfection on growth curve of HCT116 cells in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

图3 转染后对各组HCT116细胞生长曲线的影响

4 STAT3信号通路激活剂对过表达lincRNA-p21的HCT116细胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平的影响

与control组相比，pcDNA-lincRNA-p21组细胞STAT3和p-STAT3蛋白水平下调，SD19组细胞STAT3和p-STAT3蛋白上调(P<0.05)，pcDNA-lincRNA-p21+SD19组细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达的差异无统计学显著性；与pcDNA-lincRNA-p21组相比，pcDNA-lincRNA-p21+SD19组细胞的STAT3和p-STAT3蛋白水平上调(P<0.05)，见图5。这说明SD19诱导HCT116细胞中STAT3和p-STAT3蛋白上调，激活STAT3信号通路。

Figure 4.The colony formation rate of the HCT116 cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group or pcDNA group.

图4 转染后各组HCT116细胞集落形成率的变化

5 STAT3信号通路激活剂对过表达lincRNA-p21的HCT116细胞活力和凋亡的影响

处理后48 h对各组细胞的活力进行检测结果显示，control组、pcDNA-lincRNA-p21组、pcDNA-lincRNA-p21+SD19组和SD19组细胞的A值分别为0.41±0.03、0.20±0.02、0.39±0.04和0.68±0.05；对各组细胞凋亡率进行检测结果显示，control组、pcDNA-lincRNA-p21组、pcDNA-lincRNA-p21+SD19组和SD19组的细胞凋亡率分别为(7.36±0.65)%、(31.25±2.99)%、(8.12±0.79)%、(2.84±0.19)%。与control组相比，pcDNA-lincRNA-p21组细胞的A值降低，凋亡率升高，SD19组细胞的A值升高，凋亡率降低(P<0.05)，pcDNA-lincRNA-p21+SD19组细胞A值和凋亡率的差异无统计学显著性；与pcDNA-lincRNA-p21组相比，pcDNA-lincRNA-p21+SD19组细胞的A值升高,凋亡率降低(P<0.05)，见图6。这说明SD19可通过激活STST3信号通路而消除lincRNA-p21过表达对结直肠癌细胞生长的抑制作用。

Figure 5.The changes of STAT3 and p-STAT3 protein levels in the HCT116 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vspcDNA-lincRNA-p21 group.

图5 各组HCT116细胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平的变化

Figure 6.The changes of the viability (A) and apoptotic rate (B) of the HCT116 cells in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vspcDNA-lincRNA-p21 group.

图6 各组HCT116细胞活力和凋亡率的比较

讨 论

结直肠癌是我国常见的消化道内肿瘤之一，近30年来发病率年均上升3%～4%，严重危害人类健康。目前治疗结直肠癌的核心手段仍然是手术切除，手术的发展趋势是最大程度的保留功能，尽量减少创伤。因此，寻找诊断、预后和治疗结直肠癌的特异性分子标志物及有效靶点成为近年来研究的热点[12]。近年来对lncRNA了解的深入，发现lncRNA具有多种生理病理生物学功能，如mRNA的降解、染色体失活、调控染色质重塑和调控细胞生长等[13-14]。有关研究表明，不同种类的lncRNA在肿瘤组织和正常组织中的表达水平存在差异，一些lncRNA已被证实与某些疾病的发生存在密切的关系[15]。肿瘤的发生和发展常伴随着lncRNA的异常表达，lncRNA在结直肠癌的发生、侵袭和转移过程中起重要的作用，识别并确认lncRNA的生物学功能可为治疗、诊断结直肠癌提供新的理论依据[16]。lincRNA-p21是位于人第6号染色体上一类不编码蛋白质的RNA分子，具有抑癌作用。研究表明，lincRNA-p21在肿瘤组织中表达明显低于健康组织，lincRNA-p21下调表达可参与肝癌细胞周期停滞，lincRNA-p21上调表达可促进肝癌细胞凋亡[17]。LincRNA-p21还可通过调控Bax、Noxa和Puma等基因的表达抑制肾细胞癌的增殖[18]。本实验通过细胞转染法上调HCT116细胞中lincRNA-p21水平，通过MTT法检测细胞活力，结果发现HCT116细胞活力显著降低，说明过表达lincRNA-p21的HCT116细胞生长受到抑制，lincRNA-p21可以抑制结直肠癌细胞生长，具有抑制结直肠癌的作用，与上述研究相符。

STAT3属于STAT家族，是一种信号转导和转录激活子，可被细胞膜上生长因子及细胞因子激活发挥调控核内转录的作用。STAT3信号通路可通过调控具有重要功能的基因发挥调节生物学功能的作用，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞免疫和新陈代谢等[19-20]。姜黄素通过上调STAT3信号通路中靶基因Bax的表达，下调Bcl-2、Bak及survivin的表达，抑制STAT3信号分子的活化，最终抑制人胰腺癌SW1990细胞的增殖[21]。2’-羟基黄烷酮阻断Akt/STAT3信号通路抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭迁移，并伴随STAT3信号通路中相关蛋白基质金属蛋白酶9和p-STAT3的表达下调[22]。本实验采用STAT3信号通路激活剂SD19处理HCT116细胞，通过Western blot法检测STAT3信号通路中STAT3和p-STAT3蛋白水平，实验结果发现STAT3和p-STAT3蛋白水平显著升高，说明STAT3信号通路的激活剂SD19可激活STAT3信号通路。之后对结直肠癌HCT116细胞的活力进行检测，发现HCT116细胞的活力明显升高，凋亡率降低。以上实验结果提示，激活STAT3信号通路可促进结直肠癌HCT116细胞的生长，与上述研究一致。

Zhai等[23]在临床研究中发现，结直肠癌患者的结直肠癌组织中lincRNA-p21的表达明显低于癌旁组织，结直肠癌患者lincRNA-p21的表达水平低于直肠癌患者。lincRNA-p21与抑癌基因p53密切相关，p53途径可调控下游基因lincRNA-p21，通过激活lincRNA-p21的表达抑制结直肠癌细胞的生长，起到抑癌作用[23-24]。下调lincRNA-p21可抑制乏氧人肝癌SMMC7721细胞和脑胶质瘤U251MG细胞发生G2/M期阻滞，使细胞凋亡增加，细胞增殖和迁移受到抑制，细胞中HIF-1α降解，GLUT1蛋白表达下降，并调控HIF-1/Akt/mTOR/P70通路而抑制细胞自噬[25-26]。表达谱分析显示在结直肠癌组织中lincRNA-p21表达降低。上调lincRNA-p21表达可抑制β-连环蛋白表达，促进凋亡相关基因Noxa表达，从而增强放射治疗对人结直肠癌的敏感性[27]。这提示lincRNA-p21可通过靶向Wnt/β-连环蛋白信号传导途径促进结直肠癌细胞凋亡。以上研究结果显示lincRNA-p21可通过多个重要信号转导途径调节肿瘤的发生和发展。本实验结果得出，lincRNA-p21可通过调控STAT3信号通路影响结直肠癌细胞的生长。在本实验中，过表达lincRNA-p21的结直肠癌HCT116细胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平有不同幅度的下调，细胞生长受到抑制，且通过STAT3信号通路激活剂SD19处理过表达lincRNA-p21的结直肠癌HCT116细胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平有不同幅度的下调，细胞生长抑制被消除，说明lincRNA-p21可通过调控STAT3信号通路影响结直肠癌细胞的生长。

综上所述，lincRNA-p21上调可抑制结直肠癌HCT116细胞的增殖，并且其表达水平的升高引起STAT3和p-STAT3蛋白水平的降低，提示其作用机制与抑制STAT3信号有关。这表明lincRNA-p21可能成为预防和治疗结直肠癌的新的分子标志物和靶点。