全自动核酸提取检测仪选择和评价方案的建立和应用

戎国栋 赵鸿 吴蕾 黄珮珺 王芳 张燕 徐婷

近年来，随着磁珠分离技术在病毒核酸检测领域的普及应用，很多公司推出了全自动核酸提取仪［1］。此类仪器利用磁珠法进行核酸提取纯化，提高了核酸提取的效率，降低人工操作误差，实现了病毒核酸的高敏高通量检测，在临床分子检验中得到了广泛关注［2-3］，但其检测性能尚待进一步验证。由于乙型肝炎病毒核酸（hepatitis B virus DNA，HBV-DNA）检测为临床分子实验室最常见的检测项目，本文以HBV-DNA 定量检测为例，通过对6 套全自动核酸提取仪的准确性、重复性、线性相关性、检测下限、防污染能力和开放能力的临床验证，旨在建立适用于全自动核酸提取仪临床选择和评价的验证方案，为实验室实现HBV-DNA 定量检测全自动化流程提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品准备

采用阴性血清将106IU/mL 浓度水平的乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA）血清标准物质（北京康彻思坦生物技术有限公司）稀释至1×104IU/mL、1×103IU/mL、1×102IU/mL、5×101IU/mL、2×101IU/mL和1×101IU/mL，分别编号为A、B、C、D、E 和F，每个浓度梯度若干管，1 mL/管分装，-70℃冻存。

1.1.2 仪器与试剂

6 个国内外主流品牌全自动核酸提取仪，采用ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪（ThermoFisher，美国）进行扩增，COBAS Ampliprep & Taqman 48 系统（Roche，瑞士）作为定量参考。检测试剂为各厂商配套的乙型肝炎病毒核酸提取和扩增试剂盒。系统开放性评价中采用上海复星长征医学科学有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。

1.2 方法

1.2.1 防污染能力

HBV-DNA 定量结果为107IU/mL 浓度水平的临床血清样品若干份混合，分装；HBV-DNA 检测阴性样本混合，分装。在全自动提取仪中以阴阳相间的方式排列，用6 个品牌全自动核酸提取系统提取HBV-DNA，荧光定量PCR 检测，观察其防污染能力。

1.2.2 准确性试验

采用罗氏COBAS Ampliprep & Taqman 48 系统及6 个品牌全自动核酸提取系统对样品A-F 进行HBV-DNA 定量检测，每个浓度梯度重复检测2 次，取均值。通过比较各品牌仪器在对应浓度检测结果的偏倚（待评价系统检测结果平均数的对数值-罗氏结果平均数的对数值）对准确性进行评价。

1.2.3 重复性试验

A（1×104IU/mL）与C（1×102IU/mL）2 个浓度梯度的样品平行提取5 次后，进行荧光定量PCR 检测，通过极差（5 次结果中最高值的对数值-最低值的对数值）评价各仪器重复性。

1.2.4 检测下限

分析各品牌仪器所能检测出的最低检测浓度并计算检出率。

1.2.5 线性相关性

以罗氏测定值为X，各品牌检测系统测定值为Y，对样品A-F 共6 个浓度梯度检测结果计算线性范围及线性相关系数R2。

1.2.6 开放性试验

采用第三方HBV-DNA 荧光定量PCR 检测试剂盒，ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪，对各品牌仪器提取的样品A-F 的模板进行扩增，评价检测结果的准确性、重复性、检测下限以及线性相关性，并与配套检测系统比较。

2 结果

2.1 防污染能力

检测结果显示，5 种品牌仪器的高浓度阳性样本均检出，阴性标本均未检出，防污染性能高。仅有一个品牌仪器阴性标本均呈现低浓度检出，平均Ct 值为30.56，平均检测值为6.04×101IU/mL，防污染测试未通过，停止后续验证。

2.2 准确性试验

检测结果与罗氏结果的对数值差值位于±0.4之间时，准确性较高。配套系统中品牌一和品牌四准确性较高（表1），开放性系统中品牌一的准确性最高（表2）。

表1 5 种品牌仪器配套系统的准确性结果（偏倚，log）Table 1 Accuracy results of 5 instruments with matching systems（Bias，log）

表2 5 种品牌仪器开放性系统的准确性结果（偏倚，log）Table 2 Accuracy results of 5 instruments with open systems（Bias，log）

2.3 重复性试验

A（1×104IU/mL）与C（1×102IU/mL）2 个浓度的样品分别用配套系统和开放性系统平行提取5 次后，进行荧光定量PCR 检测，其5 次结果的极差如表3所示。配套系统测试中，品牌一、品牌二的重复性结果相当；但在开放性系统中，品牌一的重复性显著优于其他品牌。

表3 5 种品牌仪器的重复性结果（极差，log）Table 3 Repeatability results for 5 instruments（Range，log）

2.4 检测下限

低值样品E（2×101IU/mL）和F（1×101IU/mL）的检出率如表4所示，样品A-D 在各品牌仪器中的检出率均为100%。配套系统中，品牌一和品牌五对低值样品检出率较高，而开放性系统中品牌一低值样品检出率最佳。

表4 5 种品牌仪器的检测下限Table 4 Limit of detection for 5 instruments

2.5 线性相关性

线性范围以罗氏值为X，实际测定值为Y，在101～104IU/mL 范围内，自动核酸提取、实时荧光定量PCR 扩增方法线性范围内均良好。配套系统中，品牌一至品牌五的线性相关性R2分别为0.980、0.992、0.998、0.990、0.964，其中品牌三线性相关性系数最佳，见图1。开放性系统中，品牌一至品牌五的线性相关性R2分别为0.991、0.977、0.976、0.920、0.974，其中品牌一线性相关性系数最佳，见图2。

图1 配套系统，品牌三与罗氏检测结果线性相关性Figure 1 Matching system，linear correlation between Brand 3 and Roche system

图2 开放性系统，品牌一与罗氏检测结果线性相关性Figure 2 Open system，linear correlation between Brand 1 and Roche system

2.6 开放性试验

由上述结果可见，系统开放性评价中，采用第三方扩增试剂检测的准确性、重复性和检测下限普遍低于配套检测系统，其中品牌一在各检测参数中均表现出显著优势，开放性最佳。

3 讨论

近年来，核酸检测已成为临床分子实验中经常使用研究手段之一，其质量优劣直接影响后续实验的成败。因此，核酸提取成为分子生物学实验中的关键步骤。随着分子生物学技术的发展，核酸提取技术也从最初的手工提取发展到全自动核酸提取，同时解决了传统手工法操作复杂、重复性差、通量低等问题。目前，市场上的全自动核酸提取仪品牌繁多，性能参差不齐。根据CNAS-CL02：《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）及CNAS-CL36：2012《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》［4-5］要求，临床实验室在引入新的检测方法或检测系统时，需验证其在本实验室能否达到厂家声明的性能［6］。因此，本研究从准确性、重复性、线性相关性、检测下限、防污染能力和开放能力6个方面对目前市场上常见的6 款全自动核酸提取仪的性能进行了临床验证，制定了全自动核酸提取仪的性能验证方案，以期在众多的仪器品牌中挑选出更适用于临床分子检测领域的仪器及为实验室后续新检测仪器的引入提供参考方案。

我国作为乙肝大国，HBV-DNA 检测已成为临床分子实验室中的常规检测项目，因此本研究选择HBV-DNA 为评价指标对6 款全自动核酸提取仪进行性能验证。对于全自动核酸提取仪的性能验证，近年来陆续有文献报道，但一次性对多款仪器及多指标同步进行性能验证的类似研究尚未有先例。本研究中通过仪器试剂配套实验，结果表明品牌一、四与罗氏结果偏倚最小，准确性佳；罗氏定量检测系统具有灵敏度、精确度和可重复性高的优点，被国际公认为HBV-DNA 定量检测的参比试剂。本研究结果与李莉华等［7］在不同检测系统中应用国产核酸检测试剂研究结果相符，这可能与不同试剂盒厂家采购的原材料及生产水平差异相关。此外，本研究重复性实验结果显示品牌一、二对样品A（1×104IU/mL）与C（1×102IU/mL）的检测结果极差小，重复性佳；品牌一、五对样品F（1×101IU/mL）的检出率为100%，高于其他品牌；品牌三线性相关系数为0.998，均大于其他品牌，表明其与罗氏检测结果相关性最佳；而在开放性实验中，其准确性、重复性和检测下限均低于配套系统，但品牌一在各检测参数中显示了最佳的检测性能。在已发表的文献中，有从灵敏度、精密度［8］、检出率、精密度、重复性分别对核酸提取仪进行性能评价［9］的研究，还有对其临床可行性进行验证的研究［10］，这些研究结果都提示核酸提取仪具有操作简单、快速、提取效率高的优点，值得临床检验推广，与本研究结果相符。但在已有的研究中并未有从横向对多品牌仪器之间差异的研究，在此基础上本文对6 个品牌核酸提取仪进行了性能评价，其中仪器品牌涵盖了主流进口品牌与国产品牌，且本次研究中参与实验的研究人员跨省市开展实验、采集数据；实验结果显示开放性系统中品牌一为最优提取仪，配套系统中每个品牌各有优势，可以根据不同的实验目的选择不一样的仪器进行实验，为临床分子实验室对核酸提取仪的选择和评价提供参考和指导。

本研究的创新点还在于，首次采用了第三方扩增试剂盒评价检测系统开放性，有利于扩增试剂的多项选择，对后续自建检测项目的开展及科研应用也具有一定意义。本研究已从横向多指标对多品牌核酸提取仪进行了评价，为了更全面、更完善地了解核酸提取系统的临床检测性能，后续研究可以增加对全自动核酸提取系统的抗干扰能力（如溶血、脂血、黄疸等）［11］、对不同基因型HBV核酸检测能力［12-13］等方面的研究进一步评估检测系统的应用性能。

综上所述，经过本次性能评价，品牌一全自动核酸提取仪在配套系统和开放性试验中均表现良好，显著优于其他品牌，与Roche 定量检测系统在各指标上无明显差异，鉴于其明显的价格优势，有利于临床推广应用。本性能验证方案在全自动核酸提取仪的临床选择和评价中有效可行。