天麻蜜环提取物的抗炎活性

朱水玲， 耿 燕*， 程 鹏， 李 望， 陆震鸣，龚劲松， 许泓瑜， 史劲松， 许正宏，2

(1.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122）

天麻蜜环 （Armillaria mellea）是一种传统的药食用菌，民间主要用于头晕头痛、神经衰弱、手足发麻、小儿惊风等疾病的治疗[1]。然而受其子实体资源限制，天麻蜜环难以被广泛应用[2]。随着发酵工艺与技术的发展，天麻蜜环可以通过液态发酵法批量生产，其液态发酵产物具有与子实体相似的生物活性[2-4]。现代药理及毒理实验已证明，天麻蜜环在抗肿瘤、抗氧化、抗细胞凋亡方面具有独特功效[2-4]，然而对于天麻蜜环的抗炎活性研究甚少[5]。

炎症是机体对抗外来致炎因子刺激，发生过度防御反应而产生的一种病理过程[6]。当炎症反应过激或紊乱时机体便会分泌大量促炎因子，包括炎症介质如一氧化氮（NO），炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF-α），白介素 6（IL-6），白介素 1β（IL-1β） 等[7]。这些促炎因子的过量分泌会造成机体炎性损伤，导致脓毒症[8]、糖尿病[9]、关节炎[10]、动脉粥样硬化[11]和肿瘤[6]等炎症性疾病的发生。所以，抑制机体促炎因子的过量分泌对改善炎症反应、治疗炎症性疾病具有重要意义。

作者所在课题组前期研究对比了虫草、猴头、灵芝、天麻蜜环等菌粉提取物对脂多糖（LPS）诱导的炎症介质NO过量分泌的抑制效果，发现天麻蜜环菌粉提取物能有效抑制NO的过量分泌[12]。在前期研究的基础上，作者改良了提取工艺，进一步研究天麻蜜环提取物对LPS诱导细胞过量分泌NO，TNF-α，IL-6及IL-1β的抑制效果，更全面地探索天麻蜜环的抗炎活性，以期开发天麻蜜环这一传统中药的新的药用价值，并为从中发现新的天然抗炎药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料 天麻蜜环菌粉：由江苏神华药业有限公司提供 （生产批号：20140812）；小鼠单核巨噬RAW264.7：由江南大学药学院金坚教授实验馈赠；10 cm细胞培养皿、96孔板、6孔板：购自Thermo公司。

1.1.2 试剂 无水乙醇、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇：购自国药集团化学试剂有限公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）：购自美国Gibco公司；胰酶-EDTA消化液、青霉素-链霉素（100×）：购自碧云天生物技术有限公司；脂多糖 （LPS）、噻唑蓝（MTT）、磷酸盐缓冲液（PBS）、格里斯（Griess） 试剂、二甲亚砜（DMSO）：购自美国Sigma-Aldrich公司；TNF-α、IL-6、IL-1β 检测 ELISA 试剂盒： 购自 e-Bioscience公司。

1.1.3 仪器 旋转蒸发仪：德国Heidolph；CentriVap型冷冻离心浓缩仪：购自美国Labconco公司；Multiskan MK3型酶标仪：德国Eppendorf公司；CO2细胞培养箱，Thermo公司；倒置显微镜：Nikon公司。

1.2 实验方法

1.2.1 天麻蜜环提取物的制备 称取10 kg天麻蜜环菌粉并加入100 L 75%乙醇，室温下搅拌12 h，过滤，回收天麻蜜环菌粉滤渣至提取罐中，再加入100 L 75%乙醇，继续提取12 h，如此重复提取3次，收集并合并3次的乙醇提取液。将乙醇提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，获得天麻蜜环乙醇提取物，称重并计算得率。将乙醇提取物复溶于ddH2O并转移到分液漏斗中，依次分别加入等体积正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并萃取液旋蒸浓缩至干，分别获得天麻蜜环正己烷提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物，称重并计算得率，提取流程见图1。取少量4种有机溶剂提取物溶于二甲亚砜（DMSO）中，配制成30、100、300 mg/mL的储液，过无菌滤膜后保存于-20℃用于后续的活性检测。

图1 天麻蜜环菌粉提取流程Fig.1 Extraction scheme for Armillaria mellea

1.2.2 试剂配制 DMEM完全培养基：由DMEM基础培养基、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素双抗溶液（青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL）组成，将完全培养基封上封口膜置于4℃冰箱待用。

天麻蜜环提取物母液：分别称取天麻蜜环不同极性提取物约300 mg，反复吹氮气至3次称重质量无变化，以确保提取溶剂完全除尽。将提取物完全溶于细胞培养级二甲基亚砜（DMSO），配成300 mg/mL母液，将此母液过0.45 μm有机滤膜过滤除菌，再将母液用DMSO梯度稀释成30、100、300 mg/mL，最后将各萃取物不同质量浓度的母液封上封口膜后避光保存于4℃冰箱备用。

脂多糖（LPS）母液：将脂多糖粉末（美国sigma公司）用预装的PBS缓冲溶液配制成1 mg/mL母液，分装于不同的EP管中，留一管于4℃冰箱待用，其余保存于-20℃冰箱，避免反复冻融。

天麻蜜环提取物工作液（1 mL）：取 30、100、300 mg/mL天麻蜜环提取物母液各1 μL，分别加入到999 μL DMEM完全培养基中， 配制成 30、100、300 μg/mL工作液（溶剂DMSO被稀释1 000倍），工作液现配现用。

脂多糖（LPS）工作液（1 mL）：取 LPS 母液和DMSO溶液各1 μL至998 μL DMEM 完全培养基中，配制成 1 μg/mL LPS工作液（DMSO被稀释1 000倍，与天麻蜜环提取物工作液中DMSO的质量浓度一致，排除天麻蜜环提取物工作液中溶剂干扰），工作液现配现用。

1.2.3 RAW264.7细胞的培养 将适量细胞悬液吸入直径为10 cm的培养皿中，加入10 mL含有10%胎牛血清 （FBS）及1%抗生素 （100 U/mL青霉素；100 μg/mL链霉素）的DMEM完全培养基，将细胞放入培养箱培养过夜，培养箱条件为37℃、5%CO2。

1.2.4 MTT法检测细胞活力 将RAW264.7细胞以2×104个/孔的密度铺于96孔板孵育过夜，待细胞长至80%时换入150 μL含不同浓度天麻蜜环提取物（30、100、300 μg/mL） 的培养基培养 24 h（每组6个复孔），24 h后弃培养液，每孔加入含0.5 mg/mL MTT的培养基100 μL，孵育4 h，4 h后弃含MTT的培养基，每孔加150 μL DMSO，孵育15 min后用酶标仪检测在570 nm处测的OD值。

式中：A为药物组OD值-空白组OD值；B为对照组OD值-空白组OD值。

1.2.5 NO浓度标准曲线的绘制 根据试剂盒说明， 用 DMEM 培养基配 0～80 μmol/L的 NaNO2溶液，取上述不同浓度溶液100 μL于96孔酶标板中，再加入等体积Griess试剂，反应10～15 min后在酶标仪540 nm处读取吸光度值。以吸光度为横坐标，对应的NaNO2的浓度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.6 Griess法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生NO水平 将处于对数生长期的细胞接种于96孔板（2×104个/孔），37 ℃、5%CO2环境的培养箱中培养12 h。设空白对照组、模型组和药物作用组。空白对照组为正常状态下的细胞，模型组每孔加入150 μL、1 μg/mL LPS， 药物作用组每孔加入 150 μL 不同质量浓度天麻蜜环提取物 （30、100、300 μg/mL）预作用2 h，2 h后再以1 μg/mL LPS与对应质量浓度药物共作用细胞。24 h后取100 μL细胞上清液，并加入等体积Griess试剂，室温下反应10～15 min，酶标仪测其在540 nm处的OD值。

1.2.7 TNF-α，IL-6和IL-1β质量浓度标准曲线的绘制 根据ELISA试剂盒产品说明书将TNF-α、IL-6和IL-1β的标准品稀释至以下各质量浓度（7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1 000 pg/mL），再根据产品说明书步骤进行实验。以炎症因子（TNF-α，IL-6 和 IL-1β） 的质量浓度为纵坐标，所读取的OD值为横坐标绘制标准曲线。

1.2.8 ELISA法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF-α，IL-6和IL-1β水平 将处于对数生长期的细胞接种于 6孔板（2×105个/mL），37 ℃、5%CO2环境的培养箱中培养12 h。设空白组、模型组和药物作用组。空白组为正常状态下的细胞，模型组每孔加入2 mL 1 μg/mL LPS，药物作用组每孔加入2 mL不同质量浓度 （30，100，300 μg/mL） 天麻蜜环提取物预作用2 h，2 h后再以1 μg/mL LPS与对应质量浓度药物共作用细胞。24 h后收集细胞上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测在450 nm处的OD值。

1.2.9 数据处理 采用One-Way ANOVA统计学分析实验结果，显著性差异表示为：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001； 与 LPS 诱导组相比 ，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001。 数 据 采 用GraphPad Prism软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 天麻蜜环不同极性提取物的得率

按照1.2.1中的方法对天麻蜜环菌粉进行提取，各提取物的质量及得率见表1。得率分别为：正己烷1.90%，氯仿1.10%，乙酸乙酯1.28%，正丁醇8.11%。

表1 天麻蜜环不同极性溶剂萃取物得率Table 1 Extraction rate of organic extracts of Armillaria mellea

2.2 天麻蜜环提取物对细胞活力的影响

不同质量浓度 （30、100、300 μg/mL） 的天麻蜜环提取物与LPS共作用于RAW264.7细胞24 h后，MTT法检测各组细胞活力，结果见图2。单独加入1 μg/mL LPS对RAW264.7细胞的活力没有影响。加入不同剂量的天麻蜜环提取物与LPS共作用RAW264.7细胞24 h后，仅300 μg/mL的正己烷提取物对细胞活力有10.7%的抑制率，300 μg/mL氯仿提取物对RAW264.7的细胞活力有17%的抑制率。其余各浓度提取物对细胞活力均无明显影响，可进行进一步的抗炎活性检测。

图2 不同极性提取物对RAW264.7细胞活力的影响Fig.2 Cell viability of RAW264.7 cells exposed with or without LPS and extractions

2.3 天麻蜜环提取物降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌

根据1.2.4的方法绘制了NO标准曲线，按照1.2.5的方法检测了天麻蜜环不同极性提取物抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的水平，结果见图3。结果表明，天麻蜜环正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物均能良好的抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的功效，并具有显著的剂量依赖性。天麻蜜环正丁醇提取物能微弱地抑制LPS诱导细胞产生NO，但其没有剂量依赖性。正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物对LPS诱导细胞产生NO的半抑制浓度IC50 见表 2， 分别为：（90.2±15.8）、（91.6±10.2）、（187.6±6.8） μg/mL。 由此可见，正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物在安全质量浓度范围内均能有效抑制LPS诱导细胞产生NO。

2.4 天麻蜜环提取物降低LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌

根据1.2.6和1.2.7的方法检测了天麻蜜环不同极性提取物对LPS诱导细胞产生的炎症因子的抑制作用，结果见图4（a）-（c）。可知天麻蜜环氯仿、乙酸乙酯提取物中高剂量（100、300 μg/mL）均能显著抑制LPS诱导产生的TNF-α、IL-6和 IL-1β分泌，并呈明显的剂量依赖性。高剂量的天麻蜜环正己烷提取物能有效抑制炎症因子分泌，中低剂量效果相对不明显。而天麻蜜环正丁醇提取物没有明显效果。其中天麻蜜环乙酸乙酯提取物既具有良好的安全性又有显著的抗炎活性。

图3 天麻蜜环提取物对LPS诱导的NO的抑制效果Fig.3 Effect of extracts of Armillaria mellea on LPS induced NO production in RAW264.7 cells

表2 天麻蜜环提取物对细胞活力及促炎因子的半抑制质量浓度Table 2 IC50 of Extracts on the viability and proinflammatory factor

3 结 语

图4 天麻蜜环提取物对LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β的抑制效果Fig.4 Effect of extracts of Armillaria mellea on LPS induced TNF-α，IL-6 and IL-1β production in RAW264.7 cells

炎症是糖尿病、肿瘤、动脉粥样硬化等众多疾病的病理过程，安全有效地抑制炎症反应对于治疗各种重大疾病具有积极意义。研究发现，天麻蜜环液态发酵菌粉提取物能够抑制炎症过程中促炎因子NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的过量分泌，其正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物均具有潜在的抗炎效果，其中天麻蜜环乙酸乙酯提取物既能保证良好的安全性，又具有显著的抗炎活性，而对于天麻蜜环菌的抗炎作用机制以及抗炎活性成分尚未涉及。张红霞等人发现抑制炎症过程中NF-κB和MAPK信号通路的激活有助于减少炎症介质和细胞因子的分泌[13]。目前已从天麻蜜环中分离出40多种化合物[14]，其中天麻蜜环水提取具有抗氧化和DNA保护作用[15]，蜜环菌菌索多糖AMP-1对大鼠糖尿病型白内障具有预防和治疗作用[16]，蜜环菌庚素能够通过线粒体衰亡机制诱导人白血病细胞凋亡，具有潜在的治疗作用[17]。这提示我们进一步加强天麻蜜环提取物抗炎作用机制及其药效组成的研究对开发天麻蜜环这一传统药食用菌的抗炎应用具有更加深远而广泛的意义。