铁载体产生菌筛选、鉴定及防治Botryosphaeria dothidea

黎循航， 张言周， 李韵雅， 孙 萌， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；2.江西农业大学 生物科学与工程学院，江西南昌 330045）

葡萄座腔菌属（Botryosphaeria spp.）真菌能通过修枝、嫁接等破坏植物表皮的方式潜伏性侵染植物，可造成枝干溃疡流胶，引起植株茎杆的形成层和韧皮部收缩，阻断树液循环，导致树势消弱甚至死亡[1]。Botryosphaeria spp.可在桃树、葡萄树、梨树等多种一年生植物和多年生植物寄主上引发溃疡病、枯梢病、流胶病、轮纹病等病害，严重威胁种植业的健康发展[2-3]。目前国内常用多菌灵、甲基硫菌灵、丙环唑等杀真菌剂防治葡萄座腔菌属引起的病害，使用初期能取得一定的防治效果。但随着药物使用时间的增加，病原菌抗药性逐步增强，防治效果严重削弱[4]。加之化学杀菌剂高毒性、高残留引发的食品安全问题，促使人们寻找一种更加安全环保的替代方法防治葡萄座腔菌造成的病害。在各种生物防治方法中，有关具有拮抗作用芽孢杆菌的研究备受关注[5]。

芽孢杆菌属中的许多种对环境有益，可作为生物杀虫剂和生物杀菌剂防治植物病害[6]。芽孢杆菌拥有多种机制拮抗土壤中的病原真菌，产生铁载体是其中之一[7]。铁载体是细菌或真菌在限制性铁离子条件下产生的一类对铁离子具有特异性亲和力的低相对分子质量（400 000～1 000 000）的螯合剂，与铁离子的结合常数范围为1012～1052[8]，能够有效的降低环境中生物可利用铁离子的浓度，抑制根际微生物的生长。铁载体已经在医药、植物病害防治和植物生态修复等领域得到应用[9-11]。

蜂蜜具有高渗透性、低水活度、高酸性等不利于微生物的生长的特征。蜂蜜中微生物的来源主要与蜜蜂接触的花粉、植物、蜂房及蜜蜂肠道微生物相关。研究表明，从蜂蜜分离出的微生物中芽孢杆菌占主导地位[12]，且其中大部分芽孢杆菌展现出广谱抗菌活性，其抗菌活性物质在植物病害防治、食品防腐及临床治疗等方面具有应用价值[13-14]，因此蜂蜜可作为一种新的资源用于筛选抗菌物质产生菌。由于铁载体防治葡萄座腔菌的研究鲜为报道，故本研究的目标为：分类鉴定从未加工蜂蜜中分离筛选的细菌；考察各个菌株产生铁载体的能力；测定铁载体对葡萄座腔菌的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蜂蜜 采用产于广西扶绥地区未经加工的原蜜。

1.1.2 病原真菌 B.dothidea Ces.&De Not ACCC 38026（简写为：B.dothidea）：保存于江南大学工业生物技术教育部重点实验室。

1.1.3 培养基 DWA培养基（组分g/L）[15]：酵母膏5.0，酪蛋白胨2.0，甘油1.0，葡萄糖20.0，蔗糖400.0，琼脂 16.0。

TSB（组分 g/L）[16]：胰蛋白胨 17.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖 2.5，NaCl 5.0，K2HPO40.3；pH 7.1～7.5。

MM9 培养基 （组分 g/L）[17]：KH2PO40.3，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，NaOH 6.0，PIPES 30.24。 高压蒸汽灭菌后加入已分别灭菌的30 mL 10 g/dL去铁酪蛋白氨基酸（用3%8-羟基喹啉三氯甲烷溶液去除铁离子）， 果糖 2.0 g/L，1 mol/L MgCl21 mL，100 mmol/L CaCl2。

PDA（组分 g/L）培养基：马铃薯 200，葡萄糖20，琼脂 20；pH 自然。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分离筛选 取25 g蜂蜜与30%的葡萄糖溶液以1∶9比例混合，匀浆器高速混匀2 min，细胞悬液涂布在DWA培养基平板上，25℃培养120 h。

1.2.2 菌种16S rRNA基因分析 依据文献 [18]方法提取 DNA，使用通用引物 Fd1（5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′） 和 Rd1 （5′-AAGGAGGTGAT CCAGCC-3′）扩增各菌株的16S rRNA基因序列，生工生物工程（上海）股份有限公司测序。基因序列提交NCBI数据库，并在线BLAST以检索最为匹配的序列，使用MEGA 4构建系统发育树和分子进化分析[14]。同时，菌株16S rRNA基因序列与http：//www.ezbiocloud.net网站的典型菌株比对，鉴定其具有最高同源性的典型菌株。

1.2.3 CAS检测 按照文献[19]方法，采用铬天青S（CAS）琼脂扩散法筛选产生铁载体的菌株。取10 μL在TSB培养基中培养至对数生长期的待测菌株菌悬液点接在CAS琼脂平板上。菌株铁载体产量水平用菌落形成的橙色圈直径和菌落直径的比值（HC）表示。

1.2.4 铁载体类型鉴别 将分离纯化的菌株接种到种子培养基 （MM9），30℃、200 r/min摇瓶发酵12 h，按1%的接种体积分数转接到发酵培养基（MM9），30 ℃、200 r/min 摇瓶发酵 24 h。 发酵液10 000 r/min、4 ℃离心 20 min，上清液用 0.22 μm 滤膜过滤除菌备用。

Arnow反应：取1 mL发酵上清液溶液，加入1 mL、0.5 mol/L HCl，1 mL 钼酸盐（10 g 亚硝酸钠和10 g钼酸钠溶解于100 mL蒸馏水）和1 mL、1 mol/L NaOH溶液，混匀后静置1 h以上（待混合溶液颜色稳定），测OD510吸光度值，以2，3-二羟基苯甲酸为标品换算铁载体浓度。

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Csáky反应：取1 mL发酵上清液或铁载体溶液，加1 mL、3 mol/L H2SO4沸水浴6 h。加入3 mL醋酸钠溶液，0.5 mL碘溶液，1 mL对氨基苯磺酸溶液。3～5 min后，加入1 mL亚砷酸盐溶液。加入1 mL α-萘胺溶液，补水至 10 mL，静置 20～30 min，测OD526吸光度值，以盐酸羟胺为标准品换算铁载体浓度[17]。

1.2.5 对植物病原菌B.dothidea的抑菌效果

1）平板扩散法：将B.dothidea菌块接种在PDA平板上，27℃避光培养15 d，用无菌水洗下孢子。孢子悬液与未凝固的PDA培养基在45℃混匀，孢子数维持在105～6个/L，倒平板。凝固后用打孔器打孔，分别加入20 μL不同菌株发酵获得无菌上清液，27℃避光培养5 d，测量抑菌圈的直径。菌株铁载体发酵液抑菌效果用抑菌圈直径和孔直径的比值（HC）表示。

2）铁载体粗提物对B.dothidea的抑菌效果：按照文献[17]采用有机溶剂（儿茶酚型铁载体使用乙酸乙酯，异羟肟酸型使用苯甲醇）法萃取铁载体。发酵上清液用20%的有机溶剂萃取3次，合并有机溶剂萃取液，用真空旋转蒸发器浓缩至10 mL左右，转至真空干燥箱中除去有机溶剂，获得铁载体粗提物。

配置含不同质量浓度（0.4 、0.8、1.6、3.2、6.4 g/L）铁载体粗提物的PDA平板，接种B.dothidea菌块（d=9 mm）置于PDA平板中央，27℃避光培养5 d。测量不同铁载体浓度处理平板上病原菌菌落生长直径（mm），以不含铁载体的平板为对照，按公式（1）计算不同浓度铁载体对B.dothidea的抑制率。

将菌丝生长抑制率依据生物几率换算表换算成几率值作为依变量，铁载体质量浓度的对数为自变量，使用IBM SPSS Statistics 19软件拟合并建立毒力回归方程，并从中获得EC50和EC90的质量浓度。试验每一处理均重复3次。

1.2.6 菌株的生理生化鉴定 菌株生理生化实验依据 《伯杰氏细菌鉴定手册》[20]，碳源的利用使用API 50 CH碳水化合物试验条鉴定（bioMérieux，Inc.）[21]。

2 结果与讨论

2.1 菌种分离及系统进化树的构建

为进一步分析菌株的进化地位，采用MEGA 4.0.2软件，使用邻接法（Neighbor-Joining method）对基因序列聚类分析和系统进化树构建，结果见图1。H21菌株与B.cereus同簇，归属于蜡样芽孢杆菌。H28、H123和 H125与 Bacillus subtilis subsp 168同簇，归属于枯草芽孢杆菌。而包括H47在内的其余菌株可能更接近解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌或暹罗芽孢杆菌，需后续生理生化方法鉴定。

表1 20株蜜源分离菌株同源性分析Table 1 Homologous analysis of 20 isolated strains

研究发现，除B.cereus为毒素产生菌外，其它蜂蜜分离株由于能产生抗生素、细菌素和抗真菌物质，在农业和医疗保健上得到一定规模的应用。如从蜂蜜中分离出的B.subtilis[23]和B.amyloliquefaciens[24]能够有效的抑制造成蜜蜂幼虫疫情发生的病原菌Paenibacillus larvae和Ascosphaera apis的生长。

2.2 铁载体产生菌初筛

铁载体的测定方法多样，可依据铁载体的化学性质，铁载体的功能和生物法分别测定。CAS琼脂平板检测法[19]是利用铁载体对铁的亲和能力高于铬天青S，使染料的颜色从蓝色变成橙色，因而成为最为广泛的用于铁载体产生菌的鉴定方法。图2（a）中20个菌株分别点接在CAS琼脂平板上，菌落生长过程中的铁载体渗入琼脂培养基，竞争性螯合铁离子，使染料脱色，形成橙黄色透明圈。图2（b）中HC值为变色圈直径与菌落直径的比值，HC值的大小间接反应菌落铁载体产量的高低。20个菌株中变色圈HC值高于1.5的共有12株，其中编号为H47、H98、H114和H124的4个菌株的 HC值高于2.5，表明这4个菌株铁载体产生量可能最大。

图1 分离自蜂蜜的20株菌株16S rRNA基因系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of the 20 isolated strains by MEGA4.0.2

图2 20株分离菌株产铁载体形成变色圈及变色圈HC值Fig.2 Color-changing ring on CAS agar plate formed by 20 isolated strains and HC values

2.3 铁载体类型鉴别

铁载体的类型及产量通过化学法测定。Csáky反应用于异羟肟酸型铁载体检测，Arnow反应用于儿茶酚型铁载体检测。采用MM9培养基分别对H47、H98、H114和 H124 4株菌株液体深层发酵，发酵上清液采用Csáky反应和Arnow反应测定不同铁载体浓度，结果见表2。H47菌株Arnow反应呈阳性，Csáky反应呈阴性，表明H47菌株所产铁载体含有儿茶酚型供体基团。H114菌株Csáky反应呈阳性，Arnow反应呈阴性，表明H114菌株所产铁载体含有异羟肟酸型供体基团。H98和H124菌株Csáky反应和Arnow反应均呈阳性，表明这两个菌株产生了同时含有儿茶酚型和异羟肟酸型供体基团的混合型铁载体。

微生物铁载体的产量受环境中铁离子浓度影响，高浓度的铁离子会抑制铁载体的产生。研究铁载体产量的培养基通常严格限制铁离子的浓度，从表3可以看出，蜂蜜分离的4株菌株的铁载体产量显著高于相同培养基发酵的Xylella fastidosa菌株[25]的产量。

表2 菌株产铁载体分类Table 2 Siderophore-type classification

表3 不同微生物菌株铁载体产量Table 3 Siderophore production by diverse microorganism

2.4 铁载体抑制病原菌作用

2.4.1 发酵液对病原菌的抑制效果 铁载体能够捕获植物根际周围的铁离子，使铁离子浓度低至Fusarium oxysporum，Pythium ultimum等植物病原菌生长所需，从而抑制作物枯萎病和根腐病的发生[28-29]。由于铁载体对B.dothidea抑制效果的研究鲜有报道，作者尝试利用菌株铁载体发酵液考察其对B.dothidea的拮抗作用。将B.dothidea的孢子悬液和PDA液体培养基在45℃混匀，倒平板，凝固后打孔，分别加入H47、H98、H114和H124菌株过滤除菌的发酵液，避光培养。图3（a）表明4个分离菌株的发酵液对B.dothidea的生长均具有拮抗作用，图3（b）说明铁载体的浓度与拮抗效果正相关。拮抗效果的出现可能与铁载体的竞争性的与病原菌生长所需的铁离子结合，抑制病原菌孢子的萌发相关[30]。

图3 4株分离菌株对葡萄座腔菌的抑制效果及HC值Fig.3 Inhibitory effects of four isolated strains to B.dothidea and HC values

2.4.2 铁载体粗提物对病原菌的抑菌效果 为探究铁载体对B.dothidea的抑菌效果，分别选取H47菌株产生的儿茶酚型铁载体和H114菌株产生异羟肟酸型铁载体进行抑菌研究。不同类型铁载体对B.dothidea菌丝生长的抑制率见表4。儿茶酚型铁载体对 B.dothidea的毒力方程 y=1.432x+0.578，EC50和EC90分别为0.395 g/L和3.099 g/L，异羟肟酸型铁载体对B.dothidea的毒力方程y=1.744x+0.063，EC50和 EC90分别为 0.921 g/L 和 5.001 g/L。类似研究表明，1 mg/mL铁载体能抑制Rhizoctonia solani菌落的生长，且能溶解菌丝体[31]。植物病原菌的抑制机理可能主要是铁载体竞争结合铁离子而抑制霉菌孢子的萌发和早期萌发管的生长[32]。

依据抑制作用，推测H47菌株产生的儿茶酚型铁载体和H114菌株产生异羟肟酸型铁载体均能有效抑制B.dothidea的生长，且儿茶酚型铁载体的抑制效果优于异羟肟酸型铁载体。由此可见，H47菌株和H114菌株具有成为生物防治剂用于葡萄座腔菌病害防治的可能性。

表4 H47和H114菌株产铁载体对B.dothidea抑制作用Table 4 Inhibitory effects of siderophore produced by strain H47 and H114 to B.dothidea

2.5 菌体生理生化鉴定

为明确H47和H114菌株的分类信息，生理生化实验被用于鉴定菌株，结果见表5。H47和H114菌株生理生化特性非常相似，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》并结合API 50CH碳水化合物试验条测试，表明H47和H114菌株属于解淀粉芽孢杆菌。

表5 H47和H114菌株生理生化Table 5 Morphological and biochemical characterization of strain H47 and H114

3 结 语

作者从蜂蜜中分离出20株菌株，分别与B.cereus ATCC 14579T、B.siamensis KCTC 13613T、B.tequilensis KCTC 13622T和B.methylotrophicus CBMB205T 4种典型菌株具有最高的同源性。采用CAS 检测法表明，20 菌株中 H47、H98、H114 和H124 4个菌株菌产铁载体，且HC值均高于2.5。Csáky反应和Arnow反应结果表明，H47菌株所产铁载体为儿茶酚型（106 μmol/L），H114 菌株所产铁载体为异羟肟酸型（91 μmol/L），H98 和 H124 菌株所产铁载体为混合型（75 μmol/L 和 68 μmol/L）。 4种菌株铁载体发酵液对B.dothidea Ces.&De Not ACCC 38026均有抑制效果。H47菌株和H114菌株为解淀粉芽孢杆菌，其铁载体粗提物对B.dothidea Ces.&De Not ACCC 38026的毒力回归方程分别为y=1.432x+0.578，（EC50和 EC90分别为 0.395 g/L 和3.099 g/L）和y=1.744x+0.063 （EC50和EC90分别为0.921 g/L和5.001 g/L）。所以可以推测儿茶酚型铁载体和异羟肟酸型铁载体对葡萄座腔菌的孢子萌发及菌丝体的生长抑制效果，H47和H114菌株具有发展成为生物防治剂的潜力。