牙龈卟啉单胞菌感染致患者慢性牙周炎发病的可能机制研究

周婷，吴艳

(1.四川省第四人民医院第一门诊部口腔科，四川 成都 610000；2.川北医学院附属医院口腔科，四川 南充 637000)

牙周炎指的是牙周支持组织的慢性炎性疾病，可导致不可逆地侵袭与破坏牙周组织，使牙周丧失再生与修复能力，导致牙齿松动及脱落[1]。牙周炎是导致成人牙齿缺失的最主要原因之一，中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等口腔微生物与牙周炎的发生与发展存在密切相关性[2]。牙周膜细胞是牙周膜中最主要的组成部分，在牙周组织的保护及修复中发挥着重要作用[3]。炎症复合体是由胞质内模式识别受体家族成员之一，其中NLRP3炎症复合体研究最为广泛[4]。NLRP3炎症复合体可以激活促炎性蛋白酶caspase-1，而活化的caspase-1可切割白细胞介素-1β(IL-1β)与IL-18前体，促进IL-1β与IL-18的成熟及分泌[5]。本研究旨在探讨牙龈卟啉单胞菌感染致患者慢性牙周炎发病的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2015年1月至2017年12月四川省第四人民医院进行慢性牙周炎拔牙治疗的患者128例作为观察组，以同期进行健康体检的牙周健康的128例健康人员作为对照组。观察组中男性54例，女性74例，平均年龄(37.1±4.4)岁；对照组中男性59例，女性69例，平均年龄(37.6±4.7)岁。比较两组之间的性别与年龄分布，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)无吸烟史；(3)近1个月内未曾服用非甾体抗炎及抗菌药物。排除标准：妊娠及哺乳期妇女。

1.3 方法

采用无菌龈下刮治器刮取观察组患者磨牙牙周袋最深位点及对照组上颌第一磨牙颊侧近中位点菌斑，采用纱布隔湿干燥，将标准化灭菌纸的纸尖插至牙周袋的底部，插入10 s之后将灭菌纸取出放置于含有1 mL pH=7.2 PBS溶液的EP管中，采用实时荧光PCR对牙龈卟啉单胞菌进行检测，位点探诊深度(PD)≥4 mm，附着水平(AL)≥3 mm，临床附着丧失(CAL)≥1 mm。将观察组需要拔除的牙齿拔除，于无菌条件下刮取超过1/3的牙周膜组织，进行细胞培养，部分细胞采用牙龈卟啉单胞菌ACTT33277进行感染，部分不进行感染处理，加入蛋白酶抑制剂以及裂解液进行蛋白提取液制备，采用Western Blot对NLRP3蛋白进行检测，采用酶联免疫吸附法对IL-1β与IL-18的表达情况进行检测。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者牙龈卟啉单胞菌阳性率比较

观察组牙龈卟啉单胞菌阳性率为82.0%，显著高于对照组牙龈卟啉单胞菌阳性率18.0%，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 两组患者牙龈卟啉单胞菌阳性率比较[n(%)]

2.2 两组患者不同探诊深度牙龈卟啉单胞菌浓度比较

在5 mm、6 mm、7 mm的探诊深度时，观察组牙龈卟啉单胞菌浓度均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

组别5 mm例数浓度6 mm例数浓度7 mm例数浓度观察组364.2±0.5594.9±0.7335.6±0.7对照组810.4±0.1330.5±0.2140.8±0.2t值31.25833.04737.204P值0.0010.0010.001

2.3 观察组牙周膜细胞是否进行牙龈卟啉单胞菌感染的NLRP3、IL-1β与IL-18表达比较

观察组进行人工牙龈卟啉单胞菌感染的牙周膜细胞的NLRP3、IL-1β与IL-18表达水平显著高于未进行人工牙龈卟啉单胞菌感染的牙周膜细胞，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

组别NLRP3IL-1β(pg/mL)IL-18(pg/mL)进行人工牙龈卟啉单胞菌感染1.4±0.31865.3±389.4320.1±44.6未进行人工牙龈卟啉单胞菌感染0.7±0.11125.8±306.7121.5±39.7t值18.9737.65322.846P值0.0010.0010.001

3 讨论

慢性牙周炎患者的主要临床表现为牙齿松动、牙龈溢脓、口臭、咀嚼无力等，不仅对患者的口腔卫生造成一定危害，还与糖尿病、冠心病、消化系统疾病存在密切相关性[6]。机体抵御病原微生物的第一道天然屏障即为机体先天免疫系统，其在机体抗感染的过程中发挥着重要作用[7]。牙周炎的发生是多因素共同作用的结果[8]，具体包括：(1)牙菌斑的作用；(2)中性粒细胞多形核白细胞防御缺陷；(3)全身易感因素如基因缺陷、吞噬细胞功能缺陷、免疫缺陷等的影响；(4)炎性因子升高。本研究旨在探讨致慢性牙周炎患者牙龈卟啉单胞菌感染与NLRP3、 IL-1β与IL-18表达情况，分析慢性牙周炎发生的可能机制。

人类口腔中定植有500种左右的细菌，但大部分并非致病菌，慢性牙周炎的可疑致病微生物主要包括福赛类杆菌、变黑普氏菌、牙密螺旋体、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等[9-10]。牙龈卟啉单胞菌为一种革兰阴性厌氧菌，具有菌毛、外膜蛋白、牙龈素、膜泡等多种毒力因子，定植于口腔中的多种组织内，与牙周炎的发生密切相关[11]。牙龈卟啉单胞菌的主要致病力与牙龈蛋白酶、脂多糖、吲哚、有机酸等有关，牙龈卟啉单胞菌介导下的牙周炎性反应是慢性牙周炎的主要发病的可能机制之一[12-13]。本研究结果显示，慢性牙周炎患者牙龈卟啉单胞菌阳性率为82.0%，显著高于健康人群牙龈卟啉单胞菌阳性率18.0%，该结果提示慢性牙周炎患者牙龈卟啉单胞菌感染居于较高水平，与文献报道结果基本一致，应引起重视；牙周健康人群中牙龈卟啉单胞菌阳性率18.0%，提示牙龈卟啉单胞菌感染并非一定会导致慢性牙周炎的发生。据报道[14]，牙龈卟啉单胞菌感染达到一定水平才能引起慢性牙周炎。本研究结果显示在5 mm、6 mm、7 mm的探诊深度时，观察组牙龈卟啉单胞菌浓度均显著高于对照组，该结果提示牙龈卟啉单胞菌感染达到一定水平是导致慢性牙周炎的关键原因。

NOD样受体(NLRs)是存在于细胞质中识别病原微生物相关分子模式的模式识别受体，在发生病原微生物感染后会与特定蛋白形成蛋白复合体，在机体免疫反应和疾病发生过程中控制炎性因子的成熟及分泌[15]。NLRP3为NLRs家族的一个重要炎症复合体，主要由NLRP3的框架蛋白、caspase-1、CARD结构域的凋亡相关颗粒样接头蛋白构成，而活化的caspase-1可切割IL-1β与IL-18前体，促进IL-1β与IL-18的成熟及分泌[5]。本研究结果显示观察组进行人工牙龈卟啉单胞菌感染的牙周膜细胞的NLRP3、IL-1β与IL-18表达水平显著高于未进行人工牙龈卟啉单胞菌感染的牙周膜细胞。该结果提示牙龈卟啉单胞菌感染可以导致牙周膜细胞中NLRP3表达增加，进而促进了炎症反应的发生，导致牙周组织发生损坏。

综上所述，慢性牙周炎患者牙龈卟啉单胞菌阳性率及感染浓度均处于较高水平，牙龈卟啉单胞菌感染致慢性牙周炎发患者的牙周膜细胞的NLRP3、IL-1β与IL-18表达水平较高，这可能是牙龈卟啉单胞菌感染致患者慢性牙周炎发病的机制之一。