抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体对类风湿关节炎的诊断价值

蔡艳娟，杜娟，卢小岚，王强,2，凡瞿明，王东生

(1.川北医学院附属医院检验科；2.川北医学院医学检验系，四川 南充 637000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节炎症导致的关节损伤和功能丧失为主要表现的最常见的自身免疫疾病之一，在世界范围内发病率约1%，在我国发病率为0.3%～0.6%。部分RA患者在发病2年即可出现不可逆转的骨关节破坏而致关节畸形，进而丧失运动能力[1-2]。因此，早期诊断及尽早采取适宜的治疗，对于预防关节的损伤非常重要。

类风湿因子(rheumatoid factor，RF)和抗环瓜氨酸肽(anti-CCP)抗体作为重要的实验诊断指标被列入2009年10月美国风湿病学会(ACR)联合欧洲抗风湿病联盟(EULAR)新公布的RA诊断标准中[3-4]。近年来，研究[5-6]发现抗突变型瓜氨酸波形蛋白(anti-MCV)与RA密切相关。本研究采用全自动酶联免疫法检测血清中抗MCV，并与抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA作对比分析，探讨抗MCV在诊断RA的应用价值。现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 RA组 2017年4月至2017年6月就诊于川北医学院附属医院风湿血液科门诊及住院的RA患者79例(所有患者均符合ACR/EULAR2009的RA诊断标准)。其中，男性21例，女性58例，年龄16～84岁，平均(52.20±14.25)岁。

1.1.2 非RA结缔组织病组 同期入院的非RA自身免疫性疾病51例，包括系统性红斑狼疮(SLE)16例，未分化结缔组织病(UCTD)19例，干燥综合征(SS)6例，系统性硬化病(SSC)4例，强直性脊柱炎(AS)4例及其他结缔组织病2例，均符合国内外相应诊断标准。其中，男性22例，女性29例，年龄37～70岁，平均(45.56±9.79)岁。

1.1.3 正常对照组 同期来川北医学院附属医院进行健康体检的健康者40例。其中，男性18例，女性22例，年龄25～61岁，平均(45.60±10.67)岁。

1.2 样本的收集

所有研究对象均采集空腹静脉血，收集3～5mL于无抗凝剂管中，37℃孵育至血液凝集完全，3 500 r/min离心5 min后取血清，用于检测血清中抗MCV、抗CCP、RF IgA、RF IgG和RF IgM浓度。

1.3 实验试剂与仪器

抗MCV、RF IgA和RF IgG的检测试剂为酶联免疫吸附试验(ELISA) 定量检测抗MCV试剂盒，购自德国Orgentec公司；其检测仪器为德国Orgentec公司Alegria全自动酶联免疫分析仪。抗CCP的检测试剂为抗环瓜氨酸肽抗体CMIA试剂盒，购自美国雅培公司；其检测仪器为雅培化学发光分析仪i2000SR。RF IgM采用速率散射比浊法检测，其检测仪器为美国Beckman-Coulter公司的Immage 800双光径免疫浊度分析仪，其检测试剂为Beckman-Coulter公司配套的RF IgM检测试剂盒。

1.4 测定方法

1.4.1 血清抗MCV、RF IgA和RF IgG的测定 采用Orgentec Alegria全自动酶联免疫分析仪检测血清中抗MCV、RF IgA和RF IgG的含量。严格按仪器SOP操作规程上机检测。

1.4.2 血清抗CCP的测定 采用化学发光法检测血清中抗CCP的含量。严格按照雅培I2000SR全自动化学发光免疫分析仪的操作程序来检测样本。

1.4.3 血清RF IgM的测定 采用速率散射比浊法检测血清中RF IgM的含量。严格按照Immage 800双光径免疫浊度分析仪的操作程序来检测样本。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料均采用表示，组间两两比较采用单因素方差分析；采用受试者工作特征(ROC)曲线评价抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的诊断效能，曲线下面积比较采用Ζ检验；采用四格表计算抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA单独及其联合检测在诊断RA的灵敏性(Sen)、特异性(Spe)；RA组抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA的阳性率比较采用配对设计χ2检验；多组间百分率的比较采用χ2检验；抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA之间的相关性采用Pearson相关分析；以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA含量水平比较

采用全自动酶联免疫分析法测定血清中抗MCV，化学发光法测定抗CCP，发现RA组患者血清中抗MCV和抗CCP分别为(451.07±40.38)IU/mL、(102.65±9.36)U/mL，较非RA自身免疫性疾病组和正常对照组显著升高(P<0.01)；但非RA自身免疫性疾病组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。采用速率散射比浊法检测血清中RF IgM，全自动酶联免疫分析法测定RF IgG和RF IgA，结果显示：与正常对照组相比，RA组和非RA自身免疫性疾病组患者血清中IgM、IgG、IgA型RF的含量均明显升高(P<0.01，P<0.05)；而非RA自身免疫性疾病组比较，RA组RF IgM、RF IgG和RF IgA的含量显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 各组抗MCV、抗CCP和RF IgM含量水平的比较

*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比； #P<0.01，与AID组相比

2.2 抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的ROC曲线分析

以RA组、非RA自身免疫性疾病组和正常对照组来制作抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA诊断RA的ROC曲线，见图1。据ROC曲线取得抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA诊断RA的最佳阈值分别为54.05 IU/mL、3.45 U/mL、25.35 IU/mL、19.95 U/mL、17.00 U/mL；诊断灵敏度分别为：0.931、0.897、0.873、0.782、0.718；诊断特异性分别为0.870、0.846、0.459、0.596、0.702。其中，ROC曲线确定抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的最佳阈值与试剂说明书给出的参考值范围相近，而抗MCV的最佳阈值却高出试剂说明书提供的参考值范围，因此本文采用ROC曲线确定抗MCV的最佳阈值作为阳性阈值。

比较这5个指标的ROC曲线下面积可知，抗MCV的ROC曲线下面积最大，为0.960；然后依次是抗CCP、RF IgM、RF IgA和RF IgG，其曲线下面积分别为0.935、0.780、0.738、0.736。经Z检验统计分析，抗MCV的曲线下面积与RF IgM、RF IgG、RF IgA比较，差异有统计学意义(Z=3.713，Z=4.711，Z=4.580，P<0.05)；与抗CCP相比，RF IgM、RF IgG、RF IgA的曲线下面积变小，差异有统计学意义(Ζ=3.067，Ζ=4.008，Ζ=3.898，P<0.05)；而抗MCV与抗CCP、RF IgM与RF IgG、RF IgA间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA在RA组中阳性率比较

比较RA组病例抗MCV阳性检出率与抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的差异发现，抗MCV抗体阳性率明显高于RF IgM、RF IgG和RF IgA(P<0.05)；但与抗CCP抗体的阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表2抗MCV、抗CCP、RFIgM、RFIgG和RFIgA的ROC曲线分析结果

项目最佳阈值敏感性(%)特异性(%)AUCSEAUC的95%CI抗MCV54.0589.8791.210.9600.0180.925～0.994抗CCP3.4584.8184.610.9350.0230.891～0.980RF IgM25.3578.4846.150.780∗#0.0450.692～0.868RF IgG19.9574.6859.340.736∗#0.0440.650～0.822RF IgA17.0072.1570.320.738∗#0.0450.650～0.826

注：经Z检验，两两比较。*P<0.05，与抗MCV比较；#P<0.05，与抗CCP比较。

表3RA组病例中抗MCV与抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA的阳性率比较

项目抗CCP+-RF-IgM+-RF-IgG+-RF-IgA+-合计抗MCV +65661105813561571 -261717178合计671262175920572279χ2值1.1255.8188.64310.562P值0.2890.0120.0020.001

2.4 RA患者中抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA间相关性分析

对RA组病例中抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA进行Pearson相关性分析发现，抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA间均有相关性(P<0.05)；其中，抗MCV与抗CCP的相关性(r=0.430，P=0.000)较与其他3项指标的相关性更大。见表4。

表4RA病例中抗MCV与抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA间相关性分析

项目抗CCPRF IgMRF IgGRF IgA抗MCVr值0.4300.2720.2690.343P值0.0010.0160.0170.002

2.5 抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA联合检测的诊断效能分析

根据抗MCV、抗CCP、RF的敏感性和特异性不同，进行两两联合和全部联合检测，分析比较其诊断效能发现：抗MCV/抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA联合检测诊断RA的敏感性最高，为98.73%，但敏感性和准确性最低，分别为56.04%，75.88%；抗MCV/抗CCP联合检测的敏感性最低为92.40%，但特异性和准确性最高，分别为90.11%及91.18%。见表5。

表5抗MCV与抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA联合检测的诊断效能比较(%)

项目敏感性特异性准确性阳性似然比阴性似然比抗MCV/抗CCP92.4090.1191.1889.0291.11抗MCV/RF IgM/RF IgG/RF IgA96.2062.6478.2469.0991.94抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA94.9360.4476.4767.5790.16抗MCV/抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA98.7356.0475.8866.1094.44

3 讨论

目前，类风湿关节炎的诊断主要依靠临床表现、血清学指标、X线改变；RF和抗CCP是目前最常用且最重要的血清学指标[3-4]。RF是一种抗自身变性IgG分子Fc段的自身抗体，常与自身IgG分子结合形成稳定的免疫复合物，沉积于关节内，引起关节损伤；或者沉积于血管壁，激活补体引起坏死性血管炎等[7-8]。血清中RF主要为IgM、IgG和IgA型RF，其含量水平高低与RA的病情活动性、病情进展程度及预后密切相关。虽然RF对RA有一定的相关性和较好的敏感性，但其可出现于许多非RA结缔组织病、部分肿瘤以及感染患者中，甚至出现于一些正常老年人中，特异性不高，限制了其临床应用。抗CCP是目前广泛用于RA诊断的血清学指标。近年来，研究[9-10]发现抗CCP不仅在RA的诊断中有较高的敏感性和特异性，还与RA疾病活动程度以及关节侵蚀之间存在显著的相关性；而且，抗CCP在未分化关节炎患者未来是否发生RA具有一定的预测价值[11]。

波形蛋白是一种重要的细胞骨架蛋白，它与微管、微丝等在细胞内形成了一个完整的细胞支撑网络体系。波形蛋白在凋亡细胞内经由肽酰精氨酸亚氨酶(PAD)的瓜氨酸化，精氨酸被修饰为瓜氨酸，这就改变了原波形蛋白结构变成突变型波形蛋白(mutated citrullinated vimentin，MCV)。MCV在凋亡细胞内因得不到及时清除而导致瓜氨酸波形蛋白的持续存在，进而促进了抗MCV抗体的产生。抗MCV与抗CCP抗体有共同的抗原决定簇(与RA相关的靶抗原：瓜氨酸)，在化学结构上具有相关性[5,12-13]。因此，抗MCV作为RA新的特异性抗体逐渐成了研究热点。

本研究结果显示，RA组患者血清中抗MCV含量明显高于非RA自身免疫性疾病组和正常对照组，与何东仪等[14]报道的RA患者血清抗MCV水平一致。通过ROC曲线分析发现，抗MCV诊断RA的最佳阈值为54.05 IU/mL；其ROC曲线下面积为0.940，较RF IgM(AUC=0.780)、RF IgG(AUC=0.736)、RF IgA(AUC=0.738)明显增加(P<0.05)，但与抗CCP(AUC=0.925)比较，差异无统计学意义。这表明抗MCV对RA的诊断价值与抗CCP相当，但要明显优于RF IgM、RF IgG和RF IgA。

本研究发现抗MCV诊断RA的灵敏度和特异性分别高于抗CCP。分析原因可能是：首先，抗MCV 的抗原来源于天然蛋白，具有多个潜在的抗原决定簇；而抗CCP的是人工合成的，仅有1～2个潜在抗原决定簇；因此，抗MCV较抗CCP具有更高的特异性和敏感性[12-13]。其次，本研究采用了ROC曲线确定抗MCV的最佳阈值作为阳性阈值，而非试剂盒提供的参考值。再次，在既往研究中采用手工操作酶联免疫测定血清抗MCV，其操作过程复杂，影响因素较多，而本研究中采用的是全自动酶联免疫分析仪来测定，检测结果客观，重复性好，影响因素少。另外，抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA联合检测，可进一步提高诊断RA的敏感度，降低漏诊率；这对于RA的早期诊断、早期规范治疗、控制病情、减轻骨关节损坏程度，进而改善预后具有至关重要的作用。

本研究同时对RA组病例中抗MCV与抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA分别进行了相关性分析，结果发现抗MCV与这4项指标间均有相关性(P<0.05)。其中，抗MCV与抗CCP的相关性最大，相关系数为0.430。

综上所述，抗MCV诊断RA具有较高的敏感性和特异性，且与抗CCP相关性强，可作为诊断RA的辅助指标。抗MCV采用全自动酶联免疫分析仪检测操作简单快捷、客观、重复性好、易于标准化，具有广泛的临床应用前景。