类风湿性关节炎瓜氨酸化反应研究的最新进展

类风湿性关节炎瓜氨酸化反应研究的最新进展

常晓天郑亚冰

(山东大学附属千佛山医院医学研究中心,济南250014)

类风湿性关节炎 (Rheumatoid arthritis,RA) 是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫疾病。该病在我国发病率约3‰~5‰。RA患者体内可以检测到多种抗瓜氨酸化蛋白的自我免疫抗体(Anti-citrullinated peptide antibodies,ACPA)，包括抗角蛋白抗体(Anti-keratin antibody,AKA)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)、抗纤维蛋白原抗体(Anti-fibrinogen antibody,ACF)、抗波形蛋白抗体(Anti-vimentin antibody,anti-MCV)等[1-3]。该类抗体所针对的靶抗原均含有瓜氨酸表位，对RA具有高度的特异性，并且与疾病的严重程度密切相关。瓜氨酸是一种非编码氨基酸，在肽酰精氨酸脱亚胺酶(Peptidyl deiminase，PAD)的催化下，蛋白中的精氨酸残基转化成瓜氨酸残基，这一过程称为蛋白的瓜氨酸化。瓜氨酸化是蛋白翻译后修饰的一种形式。蛋白质的瓜氨酸化现象可见于许多疾病，如感染、炎症、肿瘤及自身免疫性疾病等[4，5]。PAD的表达及瓜氨酸反应在RA患者滑膜组织中高表达，PAD家族的PADI4基因多态性与RA呈明显相关性，且与ACPA抗体水平具有相关性，但是这种相关性具有一定的种族差异[6，7]。因此，瓜氨酸化反应和PAD在RA发病过程中起着非常重要的作用，一直是RA发病机制研究中的热点。本文将重点介绍、讨论近年来有关RA瓜氨酸化研究的进展、发展趋势以及作者对该研究的理解和建议。

1筛选新瓜氨酸化蛋白的研究

到目前为止，研究已发现了一些RA的瓜氨酸化蛋白，诸如纤维蛋白原(Fibrinogen)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、波形蛋白(Vementin)。但鉴于瓜氨酸化反应在RA发病过程中的重要作用和代谢通路的复杂性，PAD的作用底物应该不止这几种。随着分子生物学技术的进步，近年来，有更多的瓜氨酸化蛋白及自我免疫抗体在RA患者的滑膜、滑液和血液中被发现。Gro⊇b等[8]用110位早期RA患者的血液为探针对HL60细胞的蛋白进行了免疫印迹(Western blot)实验，然后用蛋白质组学的方法对杂交信号进行了鉴定，发现远端上游元件结合蛋白1和2[far upstream element-binding proteins (FUSE-BP) 1 and 2]被瓜氨酸化。我们用抗角蛋白抗体AE1/AE3(一种广谱的抗细胞角质蛋白抗体)和抗瓜氨酸抗体进行了免疫组化和免疫印迹实验，发现RA滑膜中有角质蛋白(Cytokeratin)表达并被瓜氨酸化[9]。Sawada等[10]在RA滑液中发现了瓜氨酸化的抗原C1q-binding and monoclonal rheumatoid factor (mRF)-binding peptides。最近，我们以RA患者血液为抗体对RA滑膜组织进行了的二维免疫印迹(2D-Western blot)研究，经质谱鉴定和免疫共沉淀分析发现α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、细胞角质蛋白84(KRT84)和微管蛋白B(TUBB)在滑膜中高表达并发生瓜氨酸化修饰，而且我们在RA患者的血液中也检测到高水平的抗KRT84抗体[11]。van Beers等[12]用蛋白质组学方法在RA滑液中检测出瓜氨酸化蛋白载脂蛋白E(Apolipoprotein E)、髓核分化抗原(Myeloid nuclear differentiation antigen)和β-肌动蛋白(β-actin)。同时发现细胞表面的糖调节蛋白78(Grp78)可能也是ACPA抗原之一，因为他们发现谷胱苷肽S-转移酶标记的重组Grp78(Glutathione S-transferase-tagged recombinant Grp78)瓜氨酸化之后可结合ACPA[12]。Lu等[13]用环装瓜氨酸化肽结合亲和柱(cyclic citrullinated peptide-conjugated affinity column)从RA血液中纯化了ACPA，然后用将ACPA 加入到U937 细胞(人系髓样白血病细胞系)培养液中。他们发现ACPA 可以增加细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达水平和增强NF-κB对DNA的结合能力。随着研究的深入和研究手段的进步，应该有更多的与RA有关的瓜氨酸化蛋白被发现，为揭示瓜氨酸化反应对RA的作用提供了依据。

2瓜氨酸化反应对RA骨破坏作用的研究

ACPA在RA中特异表达并且与RA病情发展密切相关,但ACPA的作用机制并不很清楚。相比在肿瘤研究领域的进展[14]，RA瓜氨酸化修饰的意义和PAD功能的研究进展并不是很快。自我免疫反应是RA中发生骨破坏的重要因素。Harre等[15]研究发现ACPA与破骨细胞(Osteoclast)调节的骨破坏密切相关，破骨细胞分化过程中波形蛋白(Vimentin)的N端发生瓜氨酸化。纯化的抗瓜氨酸化变异波形蛋白(Mutated citrullinated vimentin，MCV)抗体不仅可以结合到破骨细胞表面，而且可以刺激破骨过程和骨的吸收，因此RA anti-vimentin自我免疫抗体的形成会直接诱导骨破坏。另外，在RA滑液中检测到整合素样金属蛋白酶(ADAMTS4)高表达，ADAMTS4也是导致软骨降解的一个重要的酶，参与骨的降解[16]。ADAMTS4在其蛋白C端可与纤维连接蛋白(Fibronectin)结合，结合后其酶活性受到Fibronectin的抑制[17]。我们前期工作证明，在RA滑膜中有大量的瓜氨酸化的Fibronectin[18]。瓜氨酸化后的Fibronectin失去了对ADAMTS4调控和抑制功能，ADAMTS4活性因此得以增强而导致骨降解加速[19]。Shelef等[20]研究了瓜氨酸化修饰的Fibronectin 对滑膜成纤维状细胞(Fibroblast)的作用。他们用瓜氨酸化的Fibronectin培养了正常鼠、关节炎鼠和RA患者的Fibroblasts细胞，发现瓜氨酸的Fibronectin可以改变fibroblast细胞转移和侵入行为，因此细胞外介质的瓜氨酸化是RA病变过程的一个重要步骤[20]。

3瓜氨酸化反应参与RA炎症机制的研究

瓜氨酸化后的蛋白可转变成新的免疫原，进而刺激RA的自我免疫反应，但对其具体机制了解不多。TNF-α是免疫炎性因子调控网络中的关键因子，高水平的TNF-α可导致RA患者发生炎症反应，进而导致组织破坏。因此，TNF-α是RA生物制剂诸如益赛普、阿达木等用来治疗RA的靶点[21]。Sokolove等[22]发现瓜氨酸化的纤连蛋白(Fibronogen)更能刺激巨噬细胞表达TNF-α，而且该过程依赖于Toll样受体4/髓样分化蛋白[Toll-like receptor 4 (TLR-4)/myeloid differentiation protein (MyD88)]。Van Steendam等[23]发现瓜氨酸化蛋白可以刺激IFN-γ分泌细胞和IL-17分泌细胞增殖。他们认为瓜氨酸化依赖的(Citrulline-dependent)T细胞反应不是RA特有，但RA中高表达瓜氨酸化会打破免疫平衡，从而开启自我免疫。TNF-α本身也可以被瓜氨酸化。Moelants等[24]用PAD体外处理白介素1β(IL-1β) 和TNF-α，发现TNF-α可以被瓜氨酸化,而IL-1β不行。TNF-α 瓜氨酸化后降低了刺激人Fibroblasts制造趋化因子(chemokine)的能力，但具有维持诱导单核细胞凋亡和坏死的能力[24]。Sanchez-Pernaute等[25]用全基因组表达芯片(Whole-genome-based gene expression array)检测纤维蛋白(Fibrin)刺激后RA滑膜成纤维细胞(RASF)的全转录组表达状况。他们发现与未修饰的Fibrin相比，用PADI2体外瓜氨酸化Fibrin后，更能刺激RASF促炎性细胞因子(Pro-inflammatory cytokines)的表达，而且Fibrin 调节的炎症反应是通过 TLR4 通路进行的。

4牙周病与RA相关性的研究

人们很早就开始认为牙周病和RA之间存在某种联系。近年研究越来越多地发现牙周炎(Periodontitis)和RA发病密切相关。二者在病理上都表现为慢性炎症、骨损伤、软组织损伤，并显示有相似的免疫反应和免疫遗传机制[26-31]。一项关联分析结果表明，RA和牙周炎的相对危险度(Odds ratios)在1.8∶1(95%CI:1.0~3.2)到8∶1 (95%CI:2.9~22.1,P<0.001)变化范围内[31]。牙周炎的重要病原细菌是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)，P gingivalis是口腔菌丛的重要细菌之一，而P gingivalis细菌恰恰含有PAD，可以对肽链进行瓜氨酸化修饰，而其他的口腔细菌没有瓜氨酸化反应能力。研究还发现，野生型的P.gingivalis可以瓜氨酸化Fibrinogen 和α-烯醇化酶(α-enolase)[32,33]。Abdullah等[34]报道，P.gingivalis 的PAD存在于P gingivalis细胞表面上,并表现出热稳定和碱条件下稳定，显示P.gingivalis 中PAD在炎症条件下也应当保持其瓜氨酸化能力。Okada等[35]观察发现一旦治疗牙周炎后患者体内抗P.gingivalis抗体降低，RA病情也随之减轻。更有趣的是，清除口腔牙龈的生物沉淀后RA症状也随之缓解[36]。有人在牙周炎的龈沟液(Gingival crevicular fluid)中发现P.gingivalis，并检测到ACPA的存在[37]。Nesse等[38]也在牙周炎基质(Stroma)和牙周炎表皮(Epithelium periodontitis)上检测到和RA滑膜组织一样的大量瓜氨酸化蛋白存在。上述结果表明，P.gingivalis 因为其具有表达PAD及瓜氨酸化能力，参与RA的自我免疫进程，这也是为什么牙周炎和RA有密切关系的原因[39]。但是，Marchant等[40]认为细胞内源的PAD表达水平不受外源P.gingivalis影响，外源P.gingivalis 可能只催化细胞外介质的瓜氨酸化。

5对RA瓜氨酸化研究的建议

以上是近年来关于RA瓜氨酸化反应研究的一些最新进展，显示了该领域的研究有了很大的发展。基于对本研究领域的经验和认识，本文作者对今后RA瓜氨酸化反应的研究有如下建议：

5.1继续筛选新的RA瓜氨酸化蛋白，探索还有哪些瓜氨酸化蛋白对RA起重要作用到目前为止，已在RA滑膜中发现许多瓜氨酸化反应的靶点，但这些瓜氨酸化蛋白大都是中丰度蛋白，而且多为结构蛋白，很少有代谢通路的蛋白。这些瓜氨酸化蛋白虽然丰度低，但可能在RA调控路径中扮演十分重要的角色。所以，应该继续寻找可能的瓜氨酸化调控蛋白，并深入探索其对RA的作用。随着分子生物学技术的进步应该会有更多新的发现。Okazaki等在此方面进行过尝试，他们首先用PADI4瓜氨酸化的人软骨细胞cDNA表达库(human chondrocyte cDNA expression library)，然后用抗瓜氨酸化抗体(anti-modified citrulline antibody)和RA患者血清去免疫杂交。结果，他们筛选到真核转录起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 4G1，eIF4G1)的表达。他们的研究证明，50%的RA患者的血清中含有anti-eIF4G1抗体，而且抗体表达水平与anti-CCP 水平密切相关[41]。我们最近用2D-Western blot联合蛋白质组学方法也发现了数个新的瓜氨酸化蛋白，包括瓜氨酸化的A1AT、KRT84和TUBB[11]。我们首先用2D电泳对RA滑膜组织进行蛋白处理，获得两张一样的凝胶电泳，然后把其中一张按Western blot方法转到PVDF膜上。我们用RA患者血液对这张PVDF膜杂交，将得到的免疫信号图案与原始的凝胶电泳蛋白谱作对照，选出有杂交信号的蛋白点做质谱鉴定。我们当时用的7 cm的凝胶电泳。如果用规格更大的凝胶应当获得更多的低丰度RA瓜氨酸化蛋白。

5.2继续探索瓜氨酸化反应对RA的作用机制，分析瓜氨酸化反应如何刺激RA虽然瓜酸化反应一直是研究RA的热点，但有关其对RA的作用机制研究不多，而近年PADI4及其瓜氨酸化对肿瘤发病作用的研究很多。RA和肿瘤组织病理有很多相似之处。他山之石可以攻玉，肿瘤PADI4及其瓜氨酸化作用的研究可以开拓我们的思路。Guo等[42]用高密度蛋白芯片(High-density protein array)寻找新的PADI4底物，发现了40余个潜在的PAD底物，其中包括40S ribosomal protein S2 (RPS2)。而且该研究发现RPS2瓜氨酸化的位置恰好也是蛋白精氨酸转甲基化酶(Protein arginine methyltransferase 3，PRMT3)甲基化的位置。这种瓜氨酸化和甲基化相互拮抗而调控信号通路的现象在肿瘤细胞中也发现过[43,44]，有异曲同工之妙。

5.3以瓜氨酸化反应为靶点研发RA检测试剂和治疗药物anti-CCP是很好的RA检测试剂，但其抗原蛋白为人工的含瓜氨酸的环装蛋白，那么anti-CCP在RA抗原中是哪种蛋白、一种还是一组不得而知。近年，抗波形蛋白已开始成为检测RA的指标。因此，应该还有类似的瓜氨酸化蛋白可开发成RA的检测试剂。还有，既然瓜氨酸化反应在RA发病中起着主导作用，为什么不以瓜氨酸化反应为靶点，通过抑制瓜氨酸化反应治疗RA。肿瘤研究方面也已尝试开发抗PAD的靶向药物[45,46]。Willis等[47]用PAD的抑制药物N-α-benzoyl-N5-(2-chloro-1-iminoethyl)-L-ornithine amide (Cl-amidine)处理胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)鼠，检测Cl-amidine对关节炎的治疗作用。他们发现Cl-amidine可以有效地降低CIA鼠关节和血清中的瓜氨酸化水平、抗IgG2a anti-mouse type Ⅱcollagen抗体水平、炎症指数、C3补体沉淀和炎症指数。所以Cl-amidine可能通过抑制瓜氨酸化而抑制RA进程。Cl-amidine可能是潜在的治疗RA药物。

5.4确认RA瓜氨酸化反应的主导者(到底是PADI2还是PADI4，还是二者都参与了RA催化的瓜氨酸化反应)PAD家族共有5位PAD成员。在这5位PAD成员中，PADI4被证明与RA明显相关，是RA的易感基因。但是，早在十几年前，Vossenaar等[48]就分析了4种PAD在RA外周血和关节滑液细胞中的表达。他们在外周血单核细胞中检测到了PADI2 和 PADI4 mRNA，同时也从RA滑液中检测到了PADI2 和瓜氨酸化蛋白。Vossenaar[49]后来也在CIA鼠关节滑膜组织中检测到PADI2 mRNA，但没有检测到PADI2 蛋白表达，同时在侵入炎症关节的中性粒细胞中检测到PADI4 mRNA及其酶蛋白。他们也在人RA滑膜组织和滑液中检测到PADI4蛋白表达[50,51]。Foulquier等[52]报道在RA滑膜组织中检测到PADI2和PADI4，而且炎症细胞是PAD的主要来源。他们认为PADI2和PADI4都参与到对纤维蛋白Fibrin的瓜氨酸化过程中。我们最近用custom-designed Illumina 96-SNP VeraCode microarray和Sequenom MassARRAY方法分别对267个RA患者和307个RA患者PADI2基因的17个tagSNP进行基因分型，发现rs2235926和rs2057094与PADI2强相关，PADI2是RA易感基因。我们也在RA滑膜中检测到PADI2蛋白的表达[53]。以上数据显示，PADI2和 PADI4 都在RA滑膜中表达并可能参与RA的瓜氨酸化。尽管很多研究证明PADI4是RA易感基因并在RA病变关节组织中表达，但无法否认PADI2 甚至 PAD 其他成员也参与了RA病理进程。Darrah等[54]发现PAD有选择地催化不同的瓜氨酸化底物，PADI2修饰β/γ-actin,PADI4修饰组蛋白H3。他们建议PAD 对底物的特异性可能使RA产生不同自我免疫原[54]。Nakayama-Hamada等[55]用质谱发现，PADI2和PADI4对纤维蛋白原瓜氨酸化方式不一样，也说明PADI2和PADI4在瓜氨酸化过程中有不同作用。

综上所述，PAD和瓜氨酸化对包括RA在内的诸多疾病起着重要作用。瓜氨酸化可能和乙酰化、糖基化、甲基化、泛素化等蛋白翻译后修饰一样在代谢和基因调控中起着重要作用。有关PAD和瓜氨酸研究可能刚刚开始，今后会有更多的研究去探索PAD和瓜氨酸化调控机制、病理作用及对其药物的研发。

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[收稿2015-03-25修回2015-04-09]

(编辑倪鹏)

作者简介：常晓天(1964年-)，男，博士，研究员，博士生导师，主要从事类风湿性关节炎致病机制方面的研究，E-mail:chang-xt@163.com。

中图分类号R392.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0279-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.031