NMDA 受体在抗NMDA 受体脑炎患者卵巢畸胎瘤组织中的表达特点及意义

王观凤 郑丽娇 黄洁 彭冬先

南方医科大学珠江医院妇产科（广州510220）

抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体脑炎是一种自身免疫相关的边缘叶副肿瘤性脑炎，是目前最常见的脑炎类型之一。抗NMDA受体脑炎最早于2007年由DALMAU 等［1］首次诊断，至今仍无统一的诊断标准，目前临床主要在排除其他类型脑炎的基础上根据患者临床症状以及脑脊液和（或）血清中抗NMDA 受体抗体的发现进行临床确诊［2-3］。该脑炎病因不明确，可能与肿瘤、中枢神经系统感染、脱髓鞘性疾病、内分泌因素、性别、基因遗传因素等相关。其中，有多项研究发现女性抗NMDA 受体脑炎与卵巢畸胎瘤相关性大［4-5］，然而，卵巢畸胎瘤与抗NMDA 受体脑炎的发生机制目前仍是未完全明确的。对此，国内外学者认为其最可能的发病机制是卵巢畸胎瘤中神经组织异位表达NMDA 受体，刺激机体产生抗NMDA 受体抗体，最终导致抗NMDA 受体脑炎的发生。然而卵巢畸胎瘤作为一种女性常见卵巢肿瘤，其并发抗NMDA受体脑炎者却十分罕见，且部分卵巢畸胎瘤组织中并未含有神经组织。此外，正常情况下，NMDA受体大量表达于中枢神经系统细胞膜表面［6］，发挥细胞信号传递、突触重塑等作用，其在卵巢畸胎瘤组织中的表达及作用均不明确。总体而言，目前抗NMDA 受体脑炎的发生与卵巢畸胎瘤的存在尚缺乏明确的定论，有关于巢畸胎瘤组织中NMDA受体表达情况的研究更是少见。因此，本研究拟采用免疫组织化学方法检测抗NMDA 受体在合并抗NMDA 受体脑炎患者的卵巢畸胎瘤组织中的表达情况，研究卵巢畸胎瘤组织中NMDA 受体的表达特点及其与抗NMDA 受体脑炎的发病关系，进一步验证抗NMDA 受体脑炎与卵巢畸胎瘤两者的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2014年7月至2018年7月期间，在南方医科大学珠江医院治疗的具有完整临床病理及随访资料的抗NMDA 受体脑炎合并卵巢畸胎瘤患者病例。明确诊断抗NMDA 受体脑炎，同时合并卵巢畸胎瘤并行卵巢畸胎瘤切除手术。共8 例患者符合标准。对照组选取同期我院不伴有抗NMDA 受体脑炎的单纯卵巢畸胎瘤组织40 例（含有神经组织者20 例、不含神经组织者20 例）及正常卵巢组织20 例（来源于子宫肌瘤或腺肌瘤手术切除的卵巢）。各组临床资料具有可比性。分组情况：A 组：脑炎组卵巢畸胎瘤组织；B 组：非脑炎组畸胎瘤组织（含神经组织）；C 组：非脑炎组畸胎瘤组织（不含神经组织）；D 组：正常卵巢组织。

1.2 实验试剂与方法

1.2.1 实验试剂兔抗人NMDAR 多克隆抗体（一抗）购自美国Affinity Biosciences 公司（亲和生物公司），羊抗兔IgG 抗体（二抗）、即用型SP 试剂盒、DAB 显色试剂盒、PBS 液等均购自上海然泰生物科技有限公司。

1.2.2 实验方法采用免疫组织化学染色法。所有标本经10%福尔马林浸泡固定，石蜡包埋组织，4 μm 厚连续切片，进一步免疫组织化学染色和HE染色。NMDAR多克隆抗体工作液浓度为1∶100，按照试剂盒说明书进行免疫组化染色，用已知阳性片作为对照，以PBS液染色结果作阴性对照。

1.3 结果判定采取人工计数分析的方法统计分析免疫组化结果，以细胞膜及细胞浆出现红棕色颗粒为NMDA 受体阳性染色。每张切片随机观察5 个高倍视野（× 400），每个视野观察100 个细胞。汇总切片中阳性细胞占所观察细胞总数的百分比及阳性细胞着色强度两项指标情况，半定量判断结果。根据显色程度判断阳性强度：无特异性着色0 分，浅棕色1 分，棕黄色2 分，深红棕色3 分。染色阳性细胞所占比例按下列标准评定：阳性细胞≤10%为0 分，11%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分。两种评分方法得分相乘作为结果判断标准：0～1 分（-），2 分（+），3～4 分（++），5 分以上（+++），积分＜2为阴性，≥2 为阳性，≥5 分为强阳性。结果判定由两位病理科医师按照双盲、独立的原则进行。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件。计数资料以例数百分比表示，计数资料比较采用Fisher精确概率检验法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NMDA 受体在卵巢畸胎瘤组织中表达的一般特点（图1）NMDA 受体在卵巢畸胎瘤组织上的阳性表达为细胞膜及细胞浆呈现红棕色染色，染色程度越深提示该受体表达量越大。该受体大部分集中表达于卵巢畸胎瘤组织中的鳞状上皮组织，少部分位于腺上皮组织中，其中基底层组织表达量最高。此外，各组卵巢畸胎瘤组织中神经组织及正常卵巢组织均未见明显NMDA 受体阳性表达。

2.2 NMDA受体在不同卵巢组织中的表达差异NMDA 受体在脑炎组卵巢畸胎瘤组织阳性表达率为87.5%（7/8），强阳性率为50%；在非脑炎组卵巢畸胎瘤组织（含神经组织）中的阳性表达率为60.0%（12/20），强阳性率为5%；在非脑炎组卵巢畸胎瘤组织（不含神经组织）中的阳性率为55.0%（11/20），强阳性率为5%；在正常卵巢组织中无表达。见表1、图1。4 组卵巢组织中NMDA 受体表达的比较，经Fisher′精确概率法计算P = 0.001（P＜0.05），差异有统计学意义。

3 讨论

抗NMDA 受体脑炎是近年来发现的一种新型边缘叶副肿瘤性脑炎，是目前最常见的脑炎类型之一。2007年DALMAU 等［1］在一组合并有卵巢良性畸胎瘤的年轻女性脑炎患者体内发现了抗NMDA 抗体，并提出了抗NMDA 受体脑炎的疾病诊断。该脑炎是一种亚急性起病的炎症性脑病，多表现为短时记忆丧失、癫痫、精神障碍等，严重可导致昏迷、中枢性呼吸衰竭等，多累及边缘系统［7］。目前国内外关于该脑炎相关的研究日渐增多，但其发病机制仍未完全明确，可能的原因包括肿瘤、中枢神经系统感染、脱髓鞘性疾病、内分泌因素、性别、基因遗传因素等。目前普遍认为抗NMDA 受体脑炎是一种抗NMDA 受体抗体免疫介导而产生神经精神系统症状的自身免疫性脑炎，抗NMDA 受体抗体的产生及其与NMDA 受体复合物的抗原抗体反应是该脑炎的病理基础。

表1 NMDA 受体在不同卵巢组织中的表达情况（人工计数法）Tab.1 Expression of NMDA receptors in different ovarian tissues（Manual Counting）

图1 NMDA 受体在不同卵巢组织中的表达情况（SP×400）Fig.1 Expression of NMDA receptors in different ovarian tissues（SP×400）

NMDA 受体复合物是一种配体门控离子通道受体，广泛分布于中枢神经系统，尤其是海马及大脑皮层［6］。该复合物由多种亚基及亚型组成，包括NR1、NR2A-D 和NR3A-B 等，可提供诸多配体的结合位点，具有细胞内信号传递、兴奋性神经递质、突触传递、突触可塑等作用。在不同的神经精神疾病中，NMDA 受体复合物的功能状态不同［8］。在癫痫、脑卒中、老年痴呆、帕金森病等疾病中，NMDA 受体复合物多处于过度激活状态；而在精神分裂症中，NMDA 受体复合物的功能则处于抑制状态。抗NMDA 受体脑炎的主要致病原因就在于中枢神经系统中抗NMDA 受体抗体免疫介导引起的NMDA 受体复合物的减少及功能抑制，NMDA受体复合物进行性缺失可能是该脑炎患者疾病进展的重要原因。

目前，多数研究结果提示女性抗NMDA 受体脑炎与卵巢畸胎瘤有关［4-5］。普遍认可的发病机制是卵巢畸胎瘤中的神经组织异位过表达NMDA受体，刺激机体产生抗NMDA 受体抗体，在适宜的条件下作用于神经系统NMDA 受体复合物，导致中枢神经系统中NMDA 受体的进行性缺失，从而引起相应的神经精神症状。2008年DALMAU 等［9］用患者自身抗体和NR2B 或NR2A 特异性抗体对5 例抗NMDA 受体脑炎患者的畸胎瘤组织免疫组化染色，结果发现其与神经组织的部位一致。随后SEKI 等［10］实验得到了相似的结果。这两个实验均表明卵巢畸胎瘤可表达NMDA 受体，并可能参与了抗NMDA 受体脑炎的发生发展。本研究免疫组织化学方法结果发现脑炎组及非脑炎组卵巢畸胎瘤组织均可见NMDA 受体阳性表达，其中NMDA 受体在脑炎组卵巢畸胎瘤组织中的阳性表达率达87.5%，明显高于其在非脑炎组卵巢畸胎瘤（60.0%）及正常卵巢组织中（0%）的表达。该结果侧面验证了NMDA 受体脑炎与卵巢畸胎瘤的密切相关，这与国内外大部分文献报道结果一致。然而也进一步提示了，卵巢畸胎瘤组织中高表达的NMDA 受体可能参与了抗NMDA 受体脑炎的发生，单纯畸胎瘤的存在或者其中NMDA 受体的阳性表达均不一定导致抗NMDA 受体脑炎的发生。

与TABATA 等［11］、CLARK 等［12］研究结果一样，本研究脑炎组及非脑炎组卵巢畸胎瘤中均可见NMDA 受体阳性表达，可见卵巢畸胎瘤的存在及其中抗NMDA 受体的存在并非抗NMDA 受体脑炎发病的单一致病因素。国外大部分研究发现卵巢畸胎瘤组织中NMDA 受体阳性染色多位于神经组织中［9-10］，认为卵巢畸胎瘤中神经组织是主要的抗原提呈部位。TABATA 等［11］、DABNER 等［13］发现合并抗NMDA 受体脑炎的卵巢畸胎瘤存在较显著的瘤内淋巴细胞浸润，同样主要位于成熟的神经组织中。此外，2014年CLARK 等［12］研究结果发现单纯畸胎瘤组织及合并抗NMDA 受体脑炎卵巢畸胎瘤的中鳞状上皮组织均可表达大量的NMDA 受体。本研究中，脑炎组及非脑炎组所有卵巢畸胎瘤组织的鳞状上皮组织均可见NMDA 受体阳性表达，且基底层细胞NMDA 受体表达量最高。另外，本研究两组畸胎瘤组织中的神经组织成分均未见明确的NMDA 受体阳性表达，且并无特异性淋巴细胞浸润表现，这与国外大多数文献结果有所不同，与CLARK 等［12］研究结果一致。本研究结果提示，或者卵巢畸胎瘤组织中的鳞状上皮组织才是真正产生NMDA 受体并最终导致抗NMDA 受体脑炎发生的主要部位。由于本研究例数较少，且尚缺乏鳞状上皮组织及神经组织表达情况的对比，鳞状上皮组织是否是真正的抗原提呈部位，尚需进一步的深入研究。大部分文献［9］均提示抗NMDA 受体脑炎患者中，合并卵巢畸胎瘤者预后好，复发率低，大部分患者在切除卵巢畸胎瘤后脑炎症状可见明显的好转［10，14］。此外，国内外均可见隐匿性卵巢畸胎瘤切除术后抗NMDA 受体脑炎病情好转的报道［15］。本研究中8 例患者在行卵巢畸胎瘤切除后病情均有明显改善，恢复快，预后良好。本研究结果在探讨畸胎瘤组织中NMDA 受体表达与抗NMDA 受体脑炎的关系上，进一步验证了卵巢畸胎瘤与该脑炎的相关性。进一步肯定了抗NMDA 受体脑炎手术探查卵巢畸胎瘤的意义，尤其是单纯内科免疫治疗效果不理想的情况下。

综上所述，抗NMDA 受体脑炎病因复杂，发病机制不明确。女性抗NMDA 受体脑炎与卵巢畸胎瘤密切相关，卵巢畸胎瘤组织NMDA 受体高表达可能是卵巢畸胎瘤引起该脑炎的发病机制。临床上可疑或明确抗NMDA 受体脑炎患者，需尽快完善妇科卵巢肿瘤检查，发现卵巢畸胎瘤者建议手术切除肿瘤。此外，哪些卵巢畸胎瘤患者未来发生抗NMDA 受体脑炎的风险高，检测卵巢畸胎瘤组织中NMDA 受体表达情况或有一定的识别及预测作用。