长链非编码RNA HOTAIR 在结直肠癌中的表达、临床意义及预后分析

武雪亮 杨东东 王立坤 何琨

河北北方学院附属第一医院1普通外科，2超声医学科，3老干部科（河北张家口075000）

据最新流行病学调查显示，2014年我国居民结直肠癌发病例数位居第三位，严重威胁国民健康［1］。结直肠癌的早期诊断及规范治疗，对患者生存时间，生存质量有着重要影响。从分子生物学水平，寻找敏感度高、特异性强的标记物已成为结直肠癌早期诊断的研究热点，同时为肿瘤的放化疗、靶向治疗提供新的技术支撑。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是近年来肿瘤发病机制研究领域的一个新的方向［2］，lncRNA 系无蛋白质编码产物，却广泛参与细胞的生理、病理学过程，包括细胞周期、凋亡和信号通路的调控，其失调表现在乳腺癌、胃癌、胰腺癌等人类许多诸多恶性肿瘤中［3-5］。HOX 转录反义RNA（HOX transcript anti-sense RNA，HOTAIR）是首个被发现以反式转录方式调控基因表达的lncRNA［6］，研究证实［7-9］HOTAIR 的沉默与乳腺癌、肺癌、腺癌等人类多个肿瘤的恶性生物学行为关系密切，且抑制肿瘤中HOTAIR 的表达能有效抑制上述肿瘤细胞的生长与侵袭能力，因而成为肿瘤致癌机制及靶向研究领域一个新的研究热点。但目前，HOTAIR 在结直肠癌方面的研究较少，相关的作用机制和通路尚不明确。本研究通过检测HOTAIR 在结直肠癌中的表达情况，分析其与相关临床病理因素间的关系，结合生存时间的随访，以期为结直肠癌的早期诊断、治疗和预后监测提供准确、可靠的生物学指标。

1 资料与方法

1.1 病例资料本次实验对象为2012年1月至2014年1月间河北北方学院附属第一医院病理确诊结直肠癌组织和癌旁正常组织标本各90 例，同时收集患者完整的临床资料。

1.2 主要试剂与实验方法

1.2.1 主要试剂和仪器RNA 逆转录试剂购自Takara 公司；SYBR Green 实时定量PCR 试剂盒购自美国伯乐公司；HOTAIR 和GAPDH 引物由生工生物（北京）有限公司设计合成，全自动电化学发光免疫分析仪购自瑞士罗氏公司E2010。

1.2.2 RT-PCR法检测HOTAIR mRNA表达提取总RNA 并定量，反转录为cDNA。lincRNA HOTAIR引物，上游5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；GAPDH 引物，上游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

PCR 反应试剂：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），TaKaRa Code：DRR420A 取1 μL 逆 转录的cDNA 模板，加入10 μL 的2×PrimeSTAR Max Premix，0.4 μL 的sense primer，0.4 μL 的anti-sense primer，加灭菌蒸馏水至20 μL。轻柔混匀，离心。PCR 反应体系，95 ℃9 呼育30 s；95 ℃孵育5 s，60 ℃孵育20 s，共反应进行40 个循环；然后72 ℃孵育20 s，95 ℃孵育15 s 终止反应。荧光定量PCR实验数据处理使用2-△△Ct法，其中，中位数以上为高表达，以下则考虑低表达。

1.2.3 随访通过门诊复查、电话随访，时间为2018年10月30日。

1.3 统计学方法应用SPSS 17.0 软件分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t 检验，计数资料以百分率表示，两组比较运用χ2检验，多组比较应用方差分析，用GraphPad Prism 6 软件绘制统计图，应用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，通过Cox 回归模型分析结直肠癌患者预后的独立影响因素，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测HOTAIR mRNA 的表达以HOTAIR/GAPDH 比值作为RT-PCR 定量分析，癌组织中HOTAIR mRNA 的表达水平（0.86 ± 0.05）明显高于结直肠正常组织（0.17±0.02），差异有统计学意义（P=0.003，图1）。

2.2 HOTAIR 表达与结直肠癌临床病理特征的关系HOTAIR 的表达均与肿瘤的浸润深度、TNM分期、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润有相关性（均P ＜0.05）。TNM 分期高、分化越低，HOTAIR的表达水平越高（均P ＜0.05）；伴淋巴结转移、肝转移、脉管和神经浸润的患者HOTAIR 的表达水平明显高于未转移和非浸润的患者（均P ＜0.05）；而HOTAIR 的表达水平与患者肿瘤大小、病理类型、病变部位、肿瘤形态均无相关性（均P ＞0.05）。见表1。

2.3 HOTAIR 表达与结直肠癌患者生存的相关性随访结果显示，截止到2018年10月30日，共有48 例患者死亡，生存率为46.66%，其中死亡患者HOTAIR 表达水平为（0.880 ± 0.105），明显高于生存患者的（0.662 ± 0.113），差异有统计学意义（P = 0.002）；HOTAIR 高表达58 例，20 例生存，38例死亡，中位生存时间为23 个月，HOTAIR 低表达32 例，22 例生存，10 例死亡，中位生存时间为35个月。Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，Log-rank 单变量分析显示，HOTAIR 高表达和低表达患者的生存函数比较差异有统计学意义（χ2= 7.059，P =0.011），即HOTAIR表达水平和患者生存时间相关，HOTAIR阳性患者预后更差，见图2。

2.4 Cox 回归模型分析HOTAIR 表达水平（95%CI：1.307 ～2.912，P=0.001）、淋巴结转移（95%CI：1.041 ～1.620，P ＜0.001）、分化程度（95%CI：1.725～2.363，P = 0.035）等均是影响结直肠癌患者预后的独立因素。

图1 结直肠癌组织与正常组织lncRNA HOTAIR mRNA 相对表达量Fig.1 The relative expression of lncRNA HOTAIR mRNA in colorectal cancer tissues and normal tissues

图2 生存曲线Fig.2 Suvival cure

3 讨论

人类HOTAIR 基因位于染色体12q13 区域，HOXC11 和HOXC12 编码区之间，由1 个长外显子和5 个短外显子组成。美国斯坦福大学RINN 等［6］研究证实HOTAIR 主要通过结合一系列复杂蛋白复合体从而调控下游靶致癌基因和抑癌基因的转录和相应蛋白的表达，其中，HOTAIR 5‘结构域结合RbAp48、EZH2、EED 和SUZ12 共同组成的多梳蛋白抑制复合物PRC2，反式作用于靶基因H3 组蛋白27 位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），从而抑制下游抑癌相关靶基因的转录；另一方面，HOTAIR 3′结构域主要通过结合赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）/CoREST/REST 复合物，诱导H3 组蛋白4 位赖氨酸的去基化，从而调控相关靶基因的表达［10-11］。

表1 结直肠癌组织中lincRNA HOTAIR mRNA 的表达及与相临床病理参数的关系Tab.1 The relation of lincRNA HOTAIR mRNA expression and the clinical pathological parameters in the colorectal tissues ±s

表1 结直肠癌组织中lincRNA HOTAIR mRNA 的表达及与相临床病理参数的关系Tab.1 The relation of lincRNA HOTAIR mRNA expression and the clinical pathological parameters in the colorectal tissues ±s

临床病例特征病理类型管状腺癌绒毛状腺癌乳头状癌病变部位直肠左半结肠右半结肠分化类型高分化中分化低分化肿瘤大小＜5 cm≥5 cm肿瘤形态溃疡型隆起型浸润型淋巴结转移例数HOTAIR 表达 χ2/F 值1.905 P 值0.371 24 26 40 0.819±0.173 0.802±0.166 0.820±0.170 1.858 0.382 52 17 21 0.811±0.131 0.802±0.157 0.809±0.161 3.235 0.039 30 36 24 0.665±0.142 0.768±0.175 0.849±0.216 0.800 0.427 52 38 0.825±0.163 0.807±0.158 2.507 0.286 38 46 6 0.810±0.154 0.822±0.147 0.815±0.150 5.335＜0.001有 无56 34 0.885±0.122 0.622±0.181 TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期肝转移5.179＜0.001 24 66 0.680±0.187 0.876±0.145 6.159＜0.001有 无11 79 0.905±0.113 0.602±0.172脉管浸润4.975＜0.001有 无26 64 0.881±0.109 0.652±0.116神经浸润6.007＜0.001有无30 60 0.892±0.107 0.605±0.113

GUPTA 等［12］发现HOTMR 在乳腺癌原发灶和转移灶组织标本中的表达均升高，转移灶中HOTAIR 的表达水平高出正常上皮组织含量的200～2 000 倍，因而证实HOTAIR 的表达水平对乳腺癌的早诊和监测具有重要意义，同时，高表达HOTAIR 的肿瘤患者预后极差。KATAYAMA 等［13］研究证实HOTAIR 在肾细胞癌的发生过程中发挥重要作用，其通过调节胰岛素生长因子结合蛋白2（IGFBP2）表达增强肾癌细胞迁移，HOTAIR 与核分裂，淋巴结转移，和肺转移显著相关；LOEWEN等［14］研究证实HOTAIR 的表达在肺癌中升高并且与转移和不良预后相关，同时HOTAIR 能促进肺癌细胞的增殖，存活，侵袭，转移并增强其耐药性。SVOBODA 等［15］证实结直肠癌患者血清学HOTAIR 水平明显高于健康人群，且血清学HOTAIR 水平升高是结直肠癌患者预后的不良因素，HOTAIR 血液水平可能成为散发性结直肠癌潜在的替代预后指标。但截止目前，仍未有确切研究证实HOTAIR 在结直肠癌中的表达特性及其与癌细胞增殖、耐药、浸润和转移的关系。

本研究从基因水平证实了在结直肠癌细胞中HOTAIR mRNA 水平明显高于正常肠黏膜细胞，HOTAIR 表达水平与结直肠肿瘤的分化程度、浸润深度、TNM 分期、转移情况均密切相关，表明HOTAIR 表达的异常，打破了致癌基因和抑癌基因的平衡，激活了肿瘤细胞的活性并促进其侵袭增殖，从而加速肿瘤细胞的扩散和转移。LIN 等［16］应用逆转录定量聚合酶链式反应和Western 印迹法证实HOTAIR 在结直肠癌组织中呈高表达，且与淋巴结转移，肿瘤转移，Dukes 分期，远处转移，组织学类型和分化程度明显相关，与本研究结果一致。

本研究进一步通过随访证实，死亡患者HOTAIR 的表达水平明显高于生存患者，且HOTAIR 高表达患者生存期明显长于低表达者，差异明显，因而HOTAIR 的表达水平可作为结直肠癌患者的重要的预后监测指标，同时Cox 回归模型分析亦证实HOTAIR 表达水平是影响结直肠癌患者预后的独立因素。

综上，HOTAIR 表达的异常增高参与了结直肠癌的发生和进展过程，深入探究其致癌机制和临床耐药性的相关性有望为结直肠癌精确诊疗提供重要的理论依据，这也将是本课题下一步的研究方向。