幽门螺杆菌感染者外周血CD4+T 细胞中Notch1 mRNA 的表达及其意义

谢金玲 温俊杰 罗美群 胡冰心 吴丹琳 叶建斌 林彦青 宁云山 李妍

南方医科大学检验与生物技术学院（广州510515）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）定植于胃黏膜，引起胃部炎症反应，若持续存在感染，可加重胃黏膜的炎症反应，引发一系列的胃肠道疾病，甚至引起机体其他系统的病变［1-3］。在H.pylori 感染过程中，CD4+T 细胞主要分化成分泌IFN-γ 的Th1 细胞以抵御病原菌的感染［4］，特异性转录因子T-bet 基因是Th1 细胞分化的关键因子，促进IFN-γ因子的分泌［5］。近年来研究［6-8］表明，Notch1 在CD4+T 细胞向Th1 细胞极化过程中起重要调节作用并在一些感染性疾病中得到证实。因此，笔者推测Notch1 受体信号参与了H.pylori 感染诱导的CD4+T 细胞向Th1 细胞分化的过程。

H.pylori 感染率高，根除难，易复发，依然是全球的一大难题。因此，对H.pylori 感染后机体的免疫应答规律进行深入的研究并有效控制H.pylori的感染具有重大的社会和经济意义。目前，国内外关于Notch1 在H.pylori 感染者中的表达尚无报道。本研究通过测定CD4+T 细胞中Notch1、T-bet的mRNA 表达及血浆中IFN-γ因子的含量，分析Notch1 在H.pylori 感染时是否参与Th1 细胞的分化相关，为深入探究Notch信号通路参与Th1细胞的抗H.pylori感染的作用机制提供实验思路，未来或有望以Notch1 为靶点治疗H.pylori 的感染，为临床治疗H.pylori感染提供新思路，有效控制H.pylori的感染。

1 资料与方法

1.1 一般资料入选标准：选取江门市新会区人民医院2018年4～10月消化内科收治的在胃镜下于胃窦钳取组织作快速尿素酶试验（试纸法），同时做14C 尿素呼气试验，两者同时为阳性则判为H.pylori 阳性，两者同时为阴性者判为H.pylori 阴性，其他情况排除出实验。感染程度以14C 尿素呼气试验的dpm 值来判定。其中确认为H.pylori 感染的患者37 例，男26 例，女11 例，年龄23～86 岁，平均（58.95±2.153）岁。其中阴性的健康者35 例，男21 例，女14 例，年龄23～80 岁，平均（53.63 ±2.584）岁。排除标准：检查前1～2周内曾服用过质子泵抑制剂（PPI）或抗生素的患者；患有其他严重慢性疾病的患者。本研究已通过江门市新会区人民医院伦理委员会批准，所有研究对象已知情并签署知情同意书。两组别在性别、年龄等一般资料方面比较差异均无统计学意义。

1.2 主要材料及试剂Ficoll-Paque PLUS 淋巴分离液（Cat#71716700AG，GE Healthcare）；CD4+T 细胞分离试剂盒（Cat#MB17-R0034，MiltenyiBiotec）；RNAiso Plus 提取试剂（Cat#9109，Takara）；HiScript®ⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）RT-PCR 逆转录试剂盒（Cat#R223-01，Vazyme）；ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）QPCR 荧光定量试剂盒（Cat#Q331-01，Vazyme）；Human Interferon γ（IFN-γ）ELISA Kit 定 量 试 剂 盒（Cat#CSBE04577h，CUSABIO Biotech）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理所有受试病例采静脉肝素抗凝血5 mL。抗凝血先离心吸取上层血浆用于检测血浆IFN-γ 因子含量，剩余血样用等量生理盐水稀释，采用Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cells，PBMC），分离出来的细胞再用美天旎磁珠分离出CD4+T 细胞，1 mL PBS 重悬，取20 μL 稀释4 倍，上机计数单个核细胞，CD4+T 细胞占比均在90%以上，其余细胞离心后-80 ℃冻存至RNA 提取。

1.3.2 qRT-PCR 检测Notch1 和T-bet 的mRNA 表达Trizol 法提取各样本总RNA，以500 ng RNA 为模板，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA 第1条链，反应条件：50 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。应用荧光定量试剂盒进行qRT-PCR 反应，按照以下组分配制real time-PCR 反应体系：10 μL 2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Low ROX Premixed），0.4 μL Forward primer（10 μmol/L），0.4 μL Reverse primer（10 μmol/L），1 μL cDNA，加ddH2O至20 μL 体系。反应条件：95 ℃预变性30 s，在95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40 个循环，最后在95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s 形成熔解曲线。测试时均做3 个复孔，所测基因均用β-actin 作内参，用2-△△CT方法计算目的基因相对表达量。人Notch1 受体和β-actin 引物由本实验室前期研究设计，T-bet 转录因子的引物参考Nogueira 文献报道［9］，以上引物在广州艾基生物公司进行合成。详细引物序列见表1。

表1 Notch1、T-bet、β-actin 的qRT-PCR 引物Tab.1 Sequence of primers

1.3.3 ELISA法定量检测血浆IFN-γ因子ELISA法定量检测血浆IFN-γ 因子，严格按说明书进行操作，设8 个标准品，浓度值分别为0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 pg/mL，测定波长为450 nm，均设3 个复孔，根据各个标准品所测OD 均值，利用CurveExpert1.4 软件进行标准曲线拟合，并以样本OD 均值计算出样本浓度。

1.4 统计学方法采用GraphPad Prism 6.0 统计软件进行分析。各项计量指标以（± s）表示，样本差异检验采用独立样本t 检验，相关性采用Pearson相关分析，P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H.pylori 感染者CD4+T 细胞中Notch1 mRNA表达高于健康者为了比较H.Pylori 感染者与健康体检者CD4+T 细胞中Notch1 mRNA 的表达水平差异，利用qPCR 进行检测。见图1，与对照组中Notch1 mRNA 的表达水平（1.107±0.066 8，n=35）相比较，H.Pylori 感染组中Notch1mRNA 的表达水平（3.154 ± 0.423 6，n = 37）明显升高，差异具有统计学意义（P ＜0.000 1）。

图1 Notch1 在正常人及H.pylori 感染者CD4+T 细胞中mRNA 的表达水平Fig.1 The expression of Notch1 mRNA in CD4+T cell of Normal subjects and H.pylori-infected patients

2.2 H.pylori 感染者CD4+ T 细胞中T-bet mRNA的表达高于健康者为了比较H.Pylori 感染者与健康体检者CD4+T 细胞中T-bet mRNA 的表达水平差异，利用Q-PCR进行检测。见图2，与对照组中T-bet mRNA 的表达水平（1.178 ± 0.101 7，n = 35）相比较，H.Pylori 感染组中T-bet mRNA 的表达水平（1.793 ± 0.244 6，n = 37）升高，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

图2 T-bet 在正常人及H.pylori 感染者CD4+T 细胞中mRNA 的表达水平Fig.2 The expression of T-bet mRNA in CD4+T cell of Normal subjects and H.pylori-infected patients

2.3 H.pylori 感染者血浆中IFN-因子含量高于健康者为了比较H.Pylori 感染者与健康体检者血浆中IFN-γ因子的含量水平差异，利用ELISA 法进行定量检测。见表2，与对照组中IFN-γ因子的含量水平［（222.8 ± 45.56）pg/mL，n = 35］相比较，H.Pylori 感染组中IFN-γ 因子的含量水平［（986.7 ± 187.3）pg/mL，n = 37］明显升高，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

表2 血浆IFN-γ 因子在正常人及H.pylori 感染者中的含量水平Tab.2 The concentration of the IFN-γ in blood plasma of Normal subjects and H.pylori-infected patients ±s

表2 血浆IFN-γ 因子在正常人及H.pylori 感染者中的含量水平Tab.2 The concentration of the IFN-γ in blood plasma of Normal subjects and H.pylori-infected patients ±s

对照组H.pylori 感染组例数35 37 IFN-γ浓度（pg/mL）222.8±45.56 986.7±187.3 P 值＜0.05

2.4 H.pylori 感染组中T-bet mRNA 的表达与Notch1 mRNA 的表达呈正相关以上实验表明，H.pylori感染者CD4+T细胞中Notch1 mRNA和T-bet mRNA 表达都高于对照组，为了进一步评估T-bet的表达与Notch1 的表达是否相关，利用Pearson 相关分析对它们的表达进行评估。见图3，H.pylori感染组中T-bet mRNA 的表达水平与Notch1 mRNA表达水平呈正相关（r=0.558 6，P ＜0.000 1）。

图3 H.pylori 感染者CD4+T 细胞中T-bet 与Notch1 mRNA表达水平的相关性Fig.3 The correlation between the expression of T-bet and Notch1 mRNA in CD4+T cell of H.pylori-infected patients

2.5 H.pylori 感染组中血浆IFN-γ 因子含量与Notch1 mRNA 的表达水平的相关性以上实验表明，H.pylori 感染者中Notch1 mRNA 和IFN-γ因子的表达都高于对照组，为了进一步评估IFN-γ因子的含量与Notch1 mRNA 的表达是否相关，利用Pearson 相关分析对它们的表达进行评估。结果显示IFN-γ因子的分泌与Notch1 的表达没有相关性（P ＞0.05）。

3 讨论

已有的研究表明，细胞因子环境在CD4+T 细胞分化过程中决定着分化的方向［10-11］，但细胞因子作用模式并不能完全诠释病原体诱导CD4+T 细胞分化的机制，其他信号分子也参与调控CD4+T细胞的分化进程。因此，探索参与H.pylori 感染诱导CD4+T 细胞分化的信号传导通路，有助于理解抗H.pylori 感染的宿主防御机制及CD4+T 细胞的分化过程。

Notch 信号通路是一种高度保守的信号传导路径，广泛存在于细胞表面，在细胞的发育过程中决定细胞不同的分化方向，维持细胞的增殖、分化和凋亡的平衡。哺乳动物有4 种Notch 受体（Notch1-4）和5 种Notch 配体（Delta-like1，3，4，Jagged1和Jagged2）。Notch受体与配体结合后，胞内段在近膜处经γ-分泌酶（γ-secretase）的水解，Notch 受体胞内区（Notch intracellular domain，NICD）脱离，NICD 是Notch 受体的活化形式，其进入细胞核与核结合蛋白CSL（CBF1 suppressor of hairless-Lag1，CSL）结合，激活相关转录因子的表达。

已有研究［12］表明，Notch 信号通路在多种免疫细胞的分化中起重要作用，如参与CD4+T 细胞亚群的分化［13-14］，决定CD4+T 细胞的存活［15］，维持记忆性CD4+T 细胞的功能［15］，阻止CD4+T 细胞的凋亡［16］，初始CD4+T 细胞的表面可以检测到低水平的Notch1 和Notch2 的表达，经T 细胞受体（T cell receptor TCR）活化后CD4+T 细胞表面表达Notch信号通路的所有受体［17］。综上所述，Notch 信号通路参与CD4+T 细胞分化过程并发挥重要的调控作用。

近年来研究表明，Notch1 在CD4+T 细胞向Th1细胞极化过程中起重要调节作用［18］。Notch1 和Notch2 基因缺陷的小鼠不能分泌INF-γ，从而不能抵抗利士曼原虫的感染［19］。再生障碍性贫血患者的外周血单核细胞中NICD1（Notch1 的活化形式）与TBX21（T-bet 的编码基因）的启动子结合，调节Th1 介导的免疫反应［20］。新型隐球菌在肺部的感染过程中，Notch 信号缺失的情况下，INF-γ的分泌减少，保护性Th1 型反应明显受损［7］。在体内外CD4+T 细胞分化过程中加入GSI（γ-secretase 分泌酶抑制剂，抑制Notch 信号通路）后，转录因子T-bet 的表达降低，INF-γ的分泌减少，从而抑制Th1 细胞的分化［21-22］。阻断Notch1 信号通路可增强慢性乙型肝炎患者Th1 细胞免疫反应，这可能与慢性乙肝患者机体的免疫耐受相关［23］。可见，Notch 信号通路参与CD4+T 细胞分化成Th1 细胞。有研究表明以Notch 信号通路为靶标，可以有效防治一些炎性疾病。如用GSI 可以减轻Th1 介导的多发性硬化模型-小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）和再生障碍性贫血的症状［21-22，24］。综上所述，Notch 信号通路参与了Th1 细胞的分化并为一些炎症性疾病的治疗提供新思路。H.pylori 感染引起宿主CD4+T 细胞主要分化成分泌IFN-γ的Th1 细胞，抵御病原菌的感染［25］，但关于Notch 信号是否参与调控H.pylori 感染引起的Th1 细胞的分化，目前尚未见文献报道，因此探讨这方面的研究必将加深人们对H.pylori 感染的认知。

在本研究中，H.pylori 感染者CD4+T 细胞中Notch1 mRNA 的表达量明显比未感染者升高，差异有统计学意义，说明Notch1 在机体对抗H.pylori感染中发挥一定的作用。另外，H.pylori 感染组中T-bet mRNA 的表达水平高于健康对照组，差异具有统计学意义，这一结果表明，在H.pylori 感染后，机体存在着Th1 细胞分化的加强。随后发现，H.pylori 感染者血浆中IFN-γ的表达高于未感染者，差异有统计学意义，这一结果更加证实了H.pylori 的感染诱导Th1 细胞的分化。这结果与WEN 等［26］报道的肝纤维化的组织学分期与肝内T-bet+Th1 细胞数量呈正相关（r = 0.685）相似，肝内Th1 细胞与肝纤维化进程有关，提示着T-bet+Th1细胞与抗H.pylori的感染有关。同时，对H.pylori感染者T-bet 与Notch1 的表达进行了相关性分析，结果显示H.pylori 感染组中T-bet mRNA 表达水平与Notch1 mRNA 表达水平呈正相关（r = 0.558 6，P ＜0.000 1），提示着Notch1 参与了CD4+T 细胞向Th1 细胞的分化，从而促进了Th1 细胞抗H.pylori的感染。虽然H.pylori 感染者CD4+T 细胞中IFN-γ的表达高于未感染者，但血浆IFN-γ因子含量与Notch1 mRNA 的表达水平无相关性，这提示着血浆中IFN-γ因子的分泌，并非完全依赖于Notch1信号通路，还有其他的信号路径参与了IFN-γ因子的分泌，抵御机体抗H.pylori 感染。这结果与AUDERSET 等［19］的研究结果接近，缺乏Notch1 基因的耐利士曼原虫感染的小鼠，感染利什曼原虫后同样可引起高IFN-γ水平的保护性Th1 反应，证明Notch1 并不是Th1 分化过程的唯一关键因素。

综上所述，Notch1 在H.pylori 感染时升高，Tbet 的表达也升高，且两者呈正相关关系，说明Notch1 信号通路在抗H.pylori 感染中参与了CD4+T细胞向Th1 细胞的分化过程，发挥了一定的作用，但其并非为分泌IFN-γ因子抵御H.pylori 感染的唯一信号传导通路。因此，探索与分泌IFN-γ因子密切相关的路径，及其与H.pylori 感染的不同炎症程度，及其与胃癌发展的相关机制等问题仍需要进行深入地研究，以达到有效防治H.pylori感染。