法舒地尔与骨髓间充质干细胞共育液对大鼠脊髓损伤后氧化应激和炎症反应的影响

詹吉恒 肖方骏 罗丹 侯宇， 林定坤

1广州中医药大学第二临床医学院（广州510405）；2广州中医药大学第二附属医院骨一科（广州510120）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是脊柱专科的危重症之一，具有较高的致残率。其病理机制以继发性损伤中的神经元凋亡以及炎性反应、氧化应激损伤等为主［1］，而SCI 后积极的抗炎、抗氧化治疗，不仅能保护残存的神经元细胞，还能促进肢体功能的恢复［2］。既往研究多采用单种药物进行干预，但其收效甚微［3-4］，因此寻找一种新的治疗方式以纠正SCI 后机体的炎症和氧化应激水平是目前治疗的关键。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有高效的自我更新和增殖能力，同时能分泌细胞因子以调控内环境，故常被用作移植细胞治疗SCI［5］。但大量的研究发现移植细胞虽成功到达目标区域，脊髓伤区却未得到有效修复，多数学者推测可能是受伤区局部氧化应激、炎症反应的影响。法舒地尔（fasudil，FAS）不仅是临床常用的血管扩张药物，还对多种脏器具有保护作用，该现象与其缓解氧化应激并降低炎症反应的活性产物释放密切相关［6］。因此笔者推测使用FAS 处理BMSCs 可能提高后者在SCI 大鼠体内的活性，并调节机体氧化应激水平和炎症反应。为此，本课题组通过体外研究FAS 对BMSCs 活性的影响，并建立动物模型，以观察FAS 与BMSCs 共育液对SCI 大鼠的治疗作用及可能的机制，为后期运用干细胞移植治疗SCI提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级3 周龄雌性SD 大鼠4 只，用于提取BMSCs；SPF 级3月龄雌性SD 大鼠40 只，用于建立脊髓损伤动物模型。动物均由广东省医学实验动物中心提供，饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF 动物实验室，自由摄水饮食。

1.2 实验试剂与仪器α-MEM 培养基、胎牛血清（Gibco 公司），大鼠间充质干细胞检测试剂盒（Cyagen 公司），虎杖苷（Sigma 公司），CCK-8 试剂盒（碧云天公司），iNOS 多克隆抗体、GADPH 抗体（Abcam 公司），NF-κB 多克隆抗体（NOVUS 公司），IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒（酶联生物公司），SOD、MDA 试剂盒（南京建成公司），CO2细胞培养箱（Thermo 公司），倒置相差显微镜（Leica 公司），电泳仪、凝胶成像系统（Bio-Rad 公司），PCI-3000 精密大小鼠脊髓损伤撞击器（Hatteras Instruments 公司）。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs 的培养与鉴定取3 周龄SD 大鼠，以全骨髓贴壁法提取原代骨髓间充质干细胞，当贴壁细胞融合度达90%即可按1∶3 比例传代。取第3 代细胞，消化后制成单细胞悬液，分别取3×105个细胞进行CD44-PE、CD34-PE 染色，并设立同型阴性对照，PBS 清洗后4 ℃避光孵育二抗30 min，细胞重悬后用流式细胞仪进行细胞表型鉴定。

1.3.2 CCK-8 细胞活性检测取第3 代细胞，按1×104/孔接种于96 孔板，置于CO2培养箱中培养。细胞贴壁后，加入不同浓度FAS（3、10、30、100 μmol/L）干预24 h，各有5 个复孔。干预结束后于每孔加入10 μL CCK-8 溶液，于培养箱中继续孵育2 h 后，在酶标仪波长450 nm 处检测吸光值，并计算各组细胞活性。

1.3.3 动物分组及脊髓损伤模型建立3月龄SD大鼠随机分为4 组：假手术组、模型组、BMSCs 组、BMSCs+FAS 组，每组10 只。麻醉成功后，逐层暴露，咬除T8-T10 椎板，显露脊髓。参照改良Allen′s法，以10.0 g、0.8 mm/s 的致伤速率打击T9节段脊髓，以大鼠身体发生一过性颤抖、双下肢迅速回缩并挥动、尾巴来回摆动为模型制备成功的标志。术后连续3 d 肌注青霉素预防感染，每日2 次按摩膀胱进行人工排尿，直至大鼠恢复自主排尿功能。

1.3.4 给药方法于术后第1、3、5天通过尾静脉注射对各组大鼠进行干预。BMSCs 组：细胞消化后离心，重悬吹打成细胞悬液，调整密度为1×106/mL，取1 mL 用于尾静脉移植；BMSCs+FAS 组：按照前期研究结果，移植30 μmol/L FAS 与BMSCs 共育液，细胞密度同BMSCs 组。假手术组和模型组注射等体积生理盐水。

1.3.5 抗氧化酶系统活性测定术后1 周取伤区脊髓组织，匀浆后离心并取上清，稀释至1%浓度，以化学比色法测定脊髓组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，具体步骤按南京建成公司提供的检测试剂盒说明进行操作。

1.3.6 炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α测定脊髓组织中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量使用ELISA 法检测。将脊髓组织匀浆，提取蛋白后进行浓度测定。上样后于37 ℃孵育30 min，洗涤后加入酶标试剂继续作用30 min，最后加入显影剂并检测吸光值，按照ELISA 试剂盒说明书计算各炎症因子表达量。

1.3.7 Western blot 检测脊髓组织iNOS、NF-κB蛋白表达裂解脊髓组织，提取总蛋白，BCA 法定量后使蛋白变性。于10% SDS 电泳中分离并转膜至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭60 min，4 ℃孵 育 一 抗iNOS（1∶1000）、NF-κB（1∶1 000）和GADPH（1∶2 000）过夜，TBST 洗膜后再加入对应HRP 标记二抗室温孵育90 min，ECL 显影。以GADPH 为内参，用ImageJ 软件计算目的条带灰度值。

1.3.8 下肢运动功能评分将大鼠在术后第1、7、14、21、30 天置于旷场中自由活动5 min，根据Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分评价各组大鼠后肢运动能力。最大值为21 分，0 分表示完全瘫痪，21 分表示正常。每只大鼠均评定3 次，取其平均值。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行分析，实验数据以± s 表示。组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs 的形态提取的大鼠BMSCs 以静态贴壁形式生长，经过传代培养可纯化，呈形态规则、大小均一的梭形，第3 代细胞培养3～4 d 可达80%融合度（图1A）。

2.2 BMSCs 的流式细胞术鉴定流式细胞仪检测结果显示，CD44 表达阳性（95.1%），CD34 表达阴性（0.8%），证实所培养细胞为大鼠BMSCs（图1B～D）。

2.3 FAS 对BMSCs 活性的影响如图2 所示，与对照组相比，FAS 在3 μmol/L 浓度时对BMSCs 的活性没有显著影响（P ＞0.05），10、30 μmol/L 的FAS 可提高BMSCs 的活性，其中30 μmol/L 时细胞活性最佳（P ＜0.05），而100 μmol/L FAS 对BMSCs活性有一定抑制作用，故选用30 μmol/L FAS 用于后续实验。

图2 FAS 干预对BMSCs 细胞活性的影响Fig.2 Effects of FAS on the viability of BMSCs

2.4 BBB 评分术后BBB 评分结果显示，除假手术组外，其余组别大鼠均明显降低，但3 组间BBB评分差异无统计学意义（P ＞0.05）。与模型组比较，在术后第14、21 和30 天，BMSCs 组及BMSCs +FAS 组大鼠BBB 评分均出现不同程度改善（P ＜0.05）。术后30 d，BMSCs+FAS 组大鼠BBB 评分改善幅度优于BMSCs 组（P ＜0.05，表1）。

2.5 FAS 对SCI 大鼠脊髓组织中氧自由基的影响大鼠造模后，脊髓组织SOD 活力下降，MDA含量增加，iNOS 蛋白表达上升（P ＜0.05）。经干预后，BMSCs 组与BMSCs+FAS 组脊髓组织的SOD活力明显高于模型组（P ＜0.05），而MDA 含量及iNOS 蛋白表达则低于模型组（P ＜0.05），其中BMSCs+FAS 组iNOS 蛋白表达较BMSCs 组更低（P ＜0.05）（图3、图4A ～B）。

图3 各组脊髓组织中SOD 活力及MDA 水平Fig.3 SOD activity and MDA content in spinal cord tissues of each group

2.6 FAS 对SCI 大鼠脊髓中炎症因子含量的影响造模后，SCI 大鼠脊髓中炎症因子含量均显著升高（P ＜0.05）。与模型组比较，BMSCs 组和BMSCs+FAS 组经干预后脊髓中IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB含量均减少（P ＜0.05）。其中BMSCs+FAS 组大鼠脊髓中NF-κB 蛋白表达比BMSCs 组更低（P ＜0.05），但两组间炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量差异无统计学意义（图4A～C、图5）。

表1 各组大鼠术后不同时间点BBB 评分Tab.1 BBB scores of each group at different time points after surgery ±s

表1 各组大鼠术后不同时间点BBB 评分Tab.1 BBB scores of each group at different time points after surgery ±s

注：与模型组相比，*P ＜0.05；与BMSCs 组相比，△P ＜0.05

组别假手术组模型组BMSCs组BMSCs+FAS组术后1 d 21.0±0.00 1.2±0.84 1.4±0.55 1.3±0.45术后7 d 21.0±0.00 3.4±1.34 4.4±1.52 4.6±0.89术后14 d 21.0±0.00 4.6±1.14 7.6±1.14*7.8±1.30*术后21 d 21.0±0.00 5.6±0.89 8.4±0.55*9.4±1.82*术后30 d 21.0±0.00 6.6±1.52 9.6±0.89*11.4±1.52*△

图4 Western blot 法检测脊髓组织中iNOS、NF-κB 的蛋白表达Fig.4 The expression of iNOS,NF-κB protein detected by Western blot

图5 ELISA 检测各组脊髓组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量Fig.5 ELISA results for IL-1β，IL-6，and TNF-α in spinal cord tissues of each group

3 讨论

3.1 氧化应激与炎症反应在SCI 病理过程中的影响SCI 后氧自由基和炎症因子水平有明显的上调趋势，表明继发性损伤的发生。SCI 的已知效应之一是钙离子活化和活性氧的产生及其下游效应，导致细胞等大分子的氧化损伤，SOD 活力降低，体内氧自由基等产物堆积，氧化还原水平失衡，伴随之iNOS 表达上升［7］。其中脂质过氧化和蛋白质氧化损伤是SCI 氧化应激的重要因素，当脂质中多不饱和脂肪酸被活性氧簇攻击时即生成脂质过氧化产物MDA，而MDA 又能加剧神经元胞膜的损伤［8］。因此可以通过了解SOD 活力、MDA 含量及iNOS 表达评估氧化应激程度［9］。炎症反应作为继发性损伤的主要介质，在SCI 的发病过程中起着重要的调节作用。中枢神经系统和血液中的固有免疫细胞会引发炎症反应，随着病情发展，上述级联事件持续恶化并导致慢性炎症，引起细胞凋亡、坏死以及自噬［10］。据报道，与SCI有关的炎症相关因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α及其介质NF-κB，均被认为是导致神经损伤的重要因素［11］。由于以氧化应激和炎症反应为主的继发性损伤会造成疾病进一步恶化，因此在该节点上进行有效干预作为一种保护策略具有重大意义。

3.2 FAS与BMSCs共育液治疗SCI外源性BMSCs移植治疗SCI 由来已久，BMSCs 通过迁移，到达并整合至脊髓伤区中，借由旁分泌机制合成并分泌一系列生物活性物质，对微环境具有积极的调控作用［12］。王亮等［13］用该方法治疗SCI 大鼠模型，结果显示，BMSCs 组大鼠的脊髓组织匀浆中NF-κB、p65、IL-1β和TNF-α的水平明显低于模型组，并认为这可能是通过抑制TLR4 介导的信号传导来减少脊髓组织中炎症反应。卜志勇等［14］在类似的研究中也发现移植BMSCs 能有效调控抗氧化酶系统活性。本研究结果表明，SCI 大鼠急性期脊髓组织SOD 活性降低，而MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及iNOS、NF-κB 的蛋白表达均增加，上述指标在两个治疗组中均有所改善，其中BMSCs+FAS组改善幅度最明显，并表现出更好的后肢运动功能。表明FAS 与BMSCs 共育液可有效减轻SCI 大鼠的氧化应激和炎症反应，并发挥治疗作用。

3.3 FAS 与BMSCs 的关系徐小隔等［15］采用FAS 干预大鼠BMSCs，发现BMSCs 胞体收缩成球形，并伸出较多细长突起，且随时间正向上调NSE和MAP-2 基因表达。笔者前期研究也发现，经FAS 预处理后的BMSCs 能更多地经由尾静脉迁移至脊髓伤区，且该促迁移现象能维持3 周以上［16］。本实验研究还发现，FAS 在30 μmol/L 时细胞活性最佳，而100 μmol/L 的FAS 对BMSCs 活性有一定抑制作用。此外，FAS 还能活化Nrf2 及其下游的基因，而该现象被证实与抗氧化活性及抗炎能力成正相关［17］。上述研究结果表明FAS 对大鼠BMSCs具有促神经元样细胞分化、促迁移及提高其活性的作用，共同为FAS 联合BMSCs 移植治疗SCI 提供了有力的理论支持。

综上所述，FAS 与BMSCs 共育液移植治疗对SCI 大鼠急性期具有积极的保护作用，并有利于后期肢体运动功能恢复，这种作用可能是基于其降低脊髓伤区活性氧簇水平，提高机体抗氧化酶系统的活性，并减少炎症因子的释放。本研究为SCI的临床药物靶点治疗提供了重要线索，也为FAS的开发运用提供了方向，但内在的分子作用机制及调控通路仍有待进一步研究以明确。