植物油与肌原纤维蛋白乳化复合凝胶的结构特性

王莉莎，崔洪君，武雅琴，包海蓉,2,3*

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306) 2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306) 3(农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海，201306)

玉米油和橄榄油都是不饱和脂肪酸含量较高的植物油，营养价值较高。玉米油的多不饱和脂肪含量较高，其中饱和脂肪酸为15%，单不饱和脂肪酸为32%，多不饱和脂肪酸为53%；而橄榄油的单不饱和脂肪酸含量较高，其中饱和脂肪酸为16.4%，单不饱和脂肪酸为71.6%，多不饱和脂肪酸为12%。玉米油风味清淡爽口，容易被人体消化吸收，含有多种维生素和胡萝卜素，还具有阻止人体血清中胆固醇沉积的特殊功能[1-2]。橄榄油的脂肪酸比例合适，含有多种脂溶性维生素以及在人体中具有一定生理活性功能的游离醇和酚类抗氧化剂等[3]。

金枪鱼是一类高蛋白、低脂肪，并且富含丰富的二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)等不饱和脂肪酸的鱼类，是国际营养协会推荐的绿色无污染的健康食品[4]。肌原纤维蛋白的功能特性是影响金枪鱼品质的重要因素之一,其最重要的功能特性是凝胶特性。但前人的研究相对集中在肌原纤维蛋白和各种糖类、蛋白质的混合物或其复合凝胶上[5-7]。本实验以黄鳍金枪鱼肉为实验原料，提取其肌原纤维蛋白(myofibrillar protein, MP)与油脂复合，研究了复合凝胶油脂浓度为5%，10%和15%时的流变学性质，质构性和微观结构，以期为提高金枪鱼边角料的利用率以及在鱼肠和其他鱼糜制品的加工过程提供一定的理论基础。

1 实验材料与仪器

1.1 材料与试剂

黄鳍金枪鱼碎鱼肉，由浙江大洋世家股份有限公司提供；金龙鱼玉米油，益海嘉里食品营销有限公司；蓓琳娜特级初级初榨橄榄油，EXIOM FOOD S.L；三羟甲基氨基甲烷(THAM)、顺丁烯二酸(Maleic acid)、曲拉通(Triton-100)、牛血清白蛋白(BSA)，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

D-130 电动匀浆机，wiggens有限公司；GL-20B 高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；UV1100型紫外分光光度计，广州罡然机电设备有限公司；EVOS fl auto全自动荧光倒置显微镜系统,美国Life Technologies；MCR301流变仪，奥地利安东帕公司；TA.XT Plus质构仪，英国Stable Micro System公司；S-4800场发射扫描电子显微镜，日本日立公司。

2 实验方法

2.1 样品制备

2.1.1 肌原纤维蛋白的提取

金枪鱼肌原纤维蛋白的提取参考袁春红等[8]的方法并作适当的修改。将冻藏于-60 ℃超低温冰箱中的金枪鱼块放在4 ℃低温培养箱中，解冻大约2 h后用四通道温度计测量其中心温度，达-5 ℃左右时进行切割。准确称取5 g鱼肉，加40 mL缓冲液(内含0.16 mol/L KCl, 40 mmol/L Tris-Maleat，1% TritonX-100,pH 7.5),均质(12 000 r/min,每次10 s，间隔10 s，重复6次)，离心(4 ℃，5 000 r/min,10 min),除去上清液，继续加40 mL缓冲液(内含0.16 mol/L KCl,40 mmol/L Tris-Maleat， pH 7.5)，均质，离心(条件同上)，重复操作一次，除去上清液后，加入20 mL 0.1 mol/L NaCl，均质，离心(条件同上)，弃上清液后，加入40 ml 0.1 mol/L NaCl均质(条件同上)，2层纱布过滤，滤液离心，沉淀即为肌原纤维蛋白样品，整个提取过程需要在冰浴的条件下进行。

2.1.2 乳剂和溶胶的制备

将80 mg/mL的肌原纤维蛋白取所需量溶于0.6 mol NaCl配制成质量分数为1%的肌原纤维蛋白溶液。将1 mL油脂与4 mL质量分数为1%的蛋白质溶液混合，然后使用均浆机以3个速度8 000、15 000和22 000 r/min分别均质1 min。将含有特定油脂比例的乳剂加入到80 mg/mL的肌原纤维蛋白溶胶中用玻璃棒搅拌均匀制成复合凝胶(复合凝胶的总蛋白质含量相同)，放置24 h后使用[9]。

2.1.3 凝胶样品的制备

将复合凝胶转移置5 mL的量筒内，蛋白质溶液在80 ℃的恒温水浴中加热30 min后形成复合凝胶。将复合凝胶在4 ℃下储存24 h后进行分析[10]。

2.2 样品测定

2.2.1 肌原纤维蛋白(MP)浓度的测定

双缩脲法测肌原纤维蛋白的浓度[11]。

2.2.2 乳剂在不同转速下粒径大小观察

将制备的乳液立即分散在含有0.1%SDS的0.05%考马斯亮蓝G250中，并在装有数码相机的光学显微镜下观察[9]。

2.2.3 肌原纤维蛋白(MP)对油脂的乳化活性和乳化稳定性的测定

肌原纤维蛋白对2种植物油的乳化活性通过PEARCE和KINSELLA[12]的浊度测定法测定。将2步骤制备的新鲜乳剂从烧杯底部取20 μL乳液样品并分散到5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)中。吸光度是在紫外可见分光光度计500 nm处读数。每个样本重复3次，取平均值。按公式(1)计算乳化活性(EAI,m2/g)。

乳化性(EAI)(m2/g)=2×2.303×A×N/(C×Φ×104)

(1)

式中:C是乳化前的蛋白质质量浓度(g/mL)，Φ是乳液中油体积分数。N是稀释倍数。

乳化稳定性测定，将制备的新鲜乳剂立即分散在含有0.1%SDS的0.05%考马斯亮蓝G250中，在配置数码相机的光学显微镜下观察并拍摄照片。从烧杯底部,每隔0，30，60，120和180 min取样并记录。在500 nm处读取吸光度值,以表明乳液的稳定性，即吸光度降低表明稳定性下降[13]。整个过程在冰浴下进行,以免乳剂受到干扰，每个样本重复3次，取均值。

2.2.4 流变性质的测定

复合凝胶的流变性质通过流变仪来测定，温度扫描测试选用平行锥板(PP50，d=49.985 mm) 测试应变力为0.02，频率为0.1 Hz，缝隙为1 mm，扫描温度范围为20～80 ℃，升温速率为1 ℃/min，记录G′的变化[14]。

2.2.5 凝胶强度的测定

使用TA.XT Plus质构仪测定凝胶强度。质构分析参数设定为：前探头测试模式，探头为P/0.5，测试下降速度为 1.5 mm/s，测试时速度为 1.0 mm/s，测试后上升速度为 1.0 mm/s，测试距离为 4.0 mm，感应力为2 g，下压至 4 mm，峰值即为凝胶强度(g)。每个处理重复6次[15]。

2.2.6 持水性的测定

持水力用离心法测定，测试前称取空离心管的质量m0，混合凝胶置于离心管中后称量质量m1，然后离心管在4 ℃、10 000×g离心力下离心10 min，丢弃上清液，滤纸吸干沉淀去除水分后，称量质量为m2。每个样本重复3次[16]。

2.2.7 微观结构的测定

复合凝胶的微观结构用S-4800场发射扫描电子显微镜进行观察，主要步骤如下：将样品置于样品槽里，接着将样品在-200 ℃下进行液氮预冷，然后转移冷冻样品至传输台，升华 10 min，喷镀铂金1 min，最后转移至扫描电镜样品仓，观察。样品在观察过程中的放大倍数为5 000倍。

3 数据统计与分析

所有实验数据均为至少3次重复实验的平均值±标准偏差，数据分析采用SPSS 19.0 程序进行统计，显著性分析采用Duncan(D)程序进行(P<0.05)。

4 结果与讨论

4.1 乳剂在不同转速下油滴的粒径大小

由图1可知，随着转速的增加，玉米油和橄榄油的直径都在减小。玉米油在肌原纤维蛋白溶液里分布相对均匀，而橄榄油在肌原纤维蛋白溶液里则容易团结在一起。

a-玉米油；b-橄榄油；转速：1-8 000 r/min；2-15 000 r/min；3-22 000 r/min图1 光学显微镜下乳剂中油滴的大小(比例尺为1∶100) Fig.1 The size of the oil droplets in the emulsion under the optical microscope

4.2 乳化性

4.2.1 乳化活性指数(EAI)

乳化活性指数是指单位质量的蛋白质所产生的界面面积。由图2可知，随着转速的增加，玉米油和橄榄油的乳化活性指数均呈递增趋势，且有显著性差异(P<0.05)。且在相同的转速下，肌原纤维蛋白对玉米油的乳化活性指数大于对橄榄油的乳化活性指数。

图2 MP对玉米油和橄榄油的乳化活性指数Fig.2 Emulsification activity index of myofibrillar protein on corn oil and olive oil

4.2.2 乳化稳定性

由于蛋白质稳定乳液一般在数日内是稳定的，因此常采用诸如贮藏在高温环境或在离心环境这样的剧烈条件来评价乳化稳定性[17]。用在500 nm处读取的吸光度值以指示乳液稳定性，吸光度值降低表明稳定性下降。

表1 乳剂的乳化稳定性Table 1 Emulsification stability of emulsion

注：小写字母不同代表行之间有显著性差异(P<0.05) 大写字母不同代表列之间的有显著性差异(P<0.05)。

由表1可知，橄榄油在不同转速下，在0 min时与30、60、120和180 min的不同贮藏时间下的吸光度值有显著性差异(P<0.05)，而30、60、120和180 min的吸光度值均无显著性差异。表明橄榄油在30 min以后的乳化稳定性几乎没有太大差异且与转速无关。玉米油在8 000 r/min和15 000 r/min的转速时的乳化稳定性与橄榄油相同，在22 000 r/min时，0 min时和30 min时和60 min时的吸光度有显著性差异(P<0.05)，120 min与180 min时的吸光度没有显著性差异。表明玉米油在转速为8 000和15 000 r/min时30 min后乳化稳定性趋于稳定，但在22 000 r/min时，120 min后趋于稳定。由此可知：乳剂处理转速越大，2种油脂乳剂的乳化活性指数越大，且3种转速下的乳化稳定性没有显著性差异，因此2种油脂的乳剂都选定22 000 r/min，静置60 min。

4.3 流变性

如图3所示，复合凝胶的弹性模量的G′开始在33 ℃时增加，在35 ℃时达到极大值，然后在43 ℃时略微下降，之后随着温度的升高稳步上升。这种流变学转变在肌原纤维蛋白凝胶化中被广泛观察到这与肌球蛋白的逐步结构变化和相互作用有关。在30至40 ℃，由于S1的变性，肌球蛋白的头部发生交联，随后在40至50 ℃，由于肌球蛋白尾部(杆子片段)的展开，蛋白质网络暂时被破坏，随后达到峰值[19-20]。在图3中，在整个温度范围内，乳化的玉米油的G′增加明显，并且随着玉米油的浓度的增加而增加。

图3 不同浓度玉米油和肌原纤维复合凝胶的流变特性Fig.3 The rheological properties of different concentrations of corn oil and myofibril of composite gel

如图4所示，tanδ最初随温度升高而增加,在温度为40 ℃时下降，在43 ℃时发生第2次转变，于45 ℃时达到峰值。随后的加热导致tanδ急剧下降，符合一般的肌原纤维蛋白转化机制。

图4 不同体积分数的玉米油和肌原纤维复合凝胶的流变特性Fig.4 The rheological properties of different concentrations of corn oil and myofibril of composite gel

在图4中，乳化的玉米油的添加使得tanδ的初始值得到改善。结果表明，油脂参与了凝胶网络的形成。由于玉米油乳液是脂肪球的黏性悬浮液，因此当它们加入到MP溶胶中，特别是在高剂量水平下，有助于MP-乳液复合物的总黏度的提高。在动态流变测量过程中，当剪切时，由于脂肪球的存在，产生更多的摩擦，使得G′增加。加热前加入乳液所带来的值表明脂肪球在连续相中与蛋白质相互作用，产生具有弹性特征的无定形网络，加热导致蛋白质开始展开，随后聚集，因此与无乳液对照凝胶相比，最终产生了更大的G′。这与熊幼翎等人[9]对猪油和花生油在肌原纤维蛋白中的结论一致。

如图5和6所示，乳化的橄榄油G′对MP流变学的影响与乳化玉米油相似。所有样品，乳化橄榄油的添加都导致G′的增加，然而，橄榄油的极大值和极小值的差值较小：复合凝胶G′开始在30～40 ℃时增加幅度较小，且在43 ℃时略微下降，之后随着加热稳步上升。橄榄油乳液浓度为15%时，则更不明显。可能是与之前试验中光学显微镜下观察到的橄榄油的物理状态为“油滴较容易发生聚集，形成团聚物，从而造成流变学差异有关。

图5 不同体积分数的橄榄油和肌原纤维复合凝胶的流变特性Fig.5 The rheological properties of different concentrations of olive oil and myofibril of composite gel

图6 不同体积分数的橄榄油和肌原纤维复合凝胶的流变特性Fig.6 The rheological properties of different concentrations of olive oil and myofibril of composite gel

在整个温度范围内，乳化橄榄油的G′明显增加，并且随着橄榄油的浓度的增加而增加。但是与玉米油不同，乳化的橄榄油的添加使得初始的tanδ值降低，且随着浓度的增加，tanδ的值降低的程度越明显。当冷却至初始测试温度(20 ℃)时，乳化的橄榄油会部分团聚在一起。因此，它会对剪切产生更大的抵抗力。

另一方面，在凝胶前低温下保持液态的玉米油会更柔滑，从而产生较小的阻力。当橄榄油在较高温度下时，它的弹性高于玉米油的弹性特征。结果表明，橄榄油乳液加入MP溶胶中，降低了MP-乳液复合物的总黏度，随着温度升高至60 ℃时，形成了较大且稳定的G′。

为了更好地展示2种油脂之间的差异，将体积分数为10%的玉米油和橄榄油复合凝胶的流变曲线绘制在一起(图7和8)。

图7 10%的油脂(玉米油和橄榄油)与肌原纤维蛋白复合凝胶的流变特征Fig.7 Rheological properties of complex gel of 10% oil(corn and olive oil)and myofibrillar

图8 10%的油脂(玉米油和橄榄油)与肌原纤维蛋白复合凝胶的流变特征Fig.8 Rheological properties of complex gel of 10% oil(corn and olive oil)and myofibrillar

玉米油和橄榄油MP的G′明显随着温度的升高，差异逐渐增大，橄榄油大于玉米油，在55 ℃之前橄榄油的tanδ的也明显低于玉米油，可能是与之前实验中光学显微镜下观察到的橄榄油的物理状态“油滴较容易发生聚集，形成团聚物，从而造成流变学差异”的原因有关。当在初始测试温度(20 ℃)时，乳化的橄榄油会部分团聚在一起。因此，它会对剪切产生更大的抵抗力。另一方面，在凝胶前低温下保持液态的玉米油会更柔滑，从而产生较小的阻力。所以导致在复合凝胶中，橄榄油的G′大于玉米油的G′，而橄榄油的tanδ小于玉米油的tanδ，即在相同浓度下，单不饱和脂肪酸的含量较多的橄榄油的弹性高于多不饱和脂肪酸含量较多的玉米油的弹性。

4.4 质构特性

动态流变学测试展示了蛋白质和脂肪球在加热过程中进行的黏弹性凝胶网络的形成和发展之间的相互作用。为了进一步阐明乳化脂质对MP凝胶性质的作用，将各种浓度的乳液制备成的复合凝胶冷却并平衡至室温后，通过凝胶强度来观察。如图9所示，添加乳化的玉米油对复合凝胶的凝胶强度有明显提升(P<0.05)，且随着浓度的增加，凝胶强度也在提升，但体积分数为10%和15%时没有显著性差异。橄榄油是在体积分数为10%时，才对其凝胶强度有显著提升(P<0.05)，同样也是在体积分数为10%和15%时没有显著性差异。可以得出在一定体积分数下，复合凝胶的结构油脂的添加强化了复合凝胶的结构，这与牛丽琼等[21]的将油脂添加到鱼糜中能够提升持水能力相符合。玉米油的凝胶强度(多不饱和脂肪酸比例较高)的凝胶强度高于橄榄油(单不饱和脂肪酸比例较高)，在乳化性的测定中，玉米油在MP中的分布比橄榄油较为均匀，所以在形成复合凝胶时，玉米油的分布的均匀性也高于橄榄油，从而导致其凝胶强度较好。

图9 不同浓度油脂(玉米油和橄榄油)对复合凝胶的凝胶强度的影响Fig.9 Effects of different concentrations of oils (corn oil and olive oil) on the gel strength of composite gels

4.5 持水力

鱼肉制品的凝胶特性是凝胶强度和持水性等的综合体现，也是衡量其品质的重要指标[22]。将各种浓度的乳液制备的复合凝胶冷却并平衡至室温后，通过持水力观察如图10所示，玉米油和橄榄油都是在体积分数为10%和15%时对持水力有显著提升(P<0.05)，并且在15%时效果最好。这可能是由于脂肪球在凝胶形成过程中填充进凝胶的空间三维网状结构中，增加了复合凝胶持水性，这与吴满刚等人[23]的研究结果一致。与质构特性一致，玉米油(多不饱和脂肪酸比例较高)的持水力高于橄榄油(单不饱和脂肪酸比例较高)的持水力，可能是由于玉米油分布均匀，网络状结构相对均衡，所以对水的维持能力要高于橄榄油。

图10 不同体积分数油脂(玉米油和橄榄油)对复合凝胶的持水力的影响Fig.10 Effect of different concentrations of oil (corn oil and olive oil) on the water holding capacity of composite gel

4.6 微观结构

通过电镜扫描观察复合凝胶的微观结构，选取体积分数为15%的玉米油和橄榄油形成的复合凝胶的微观结构(图11)。从断裂面可以观察到，在油脂与凝胶网络的接触部分，油脂颗粒都与凝胶网络有明显的交联，表明乳化的脂肪球与凝胶网络之间可能存在一定的相互作用，不是独立的存在于凝胶网络之中，可能是由于脂肪球表面的蛋白质膜与凝胶网络发生交联，对维持和稳定蛋白质结构的作用力造成影响，当达到一定浓度时可提高复合凝胶的流变性质和质构特性。

a-空白对照；b-含15%玉米油的复合凝胶；c-含15%橄榄油的复合凝胶图11 凝胶的微观结构图Fig.11 Microstructure of the gel

5 结论

本实验将植物油与金枪鱼肌原纤维乳化复合形成复合凝胶，油脂选取了体积分数分别为5%、10%和15%，油脂的添加对肌原纤维蛋白的影响通过流变学特征、质构、持水性和微观结构来表示：复合凝胶的G′随着油脂浓度的上升，在不断增加；通过油脂的添加，玉米油的凝胶强度得到较明显的改善，10%与15%时无显著性差异，而橄榄油的体积分数在复合凝胶中占10%和15%时才有明显的改善，且当体积分数为10%与15%时无显著性差异；2种油脂的持水力在体积分数增加到10%时开始提升，且浓度在15%时，持水力最好；2种油脂的复合凝胶的G′，橄榄油(单不饱和脂肪酸比例较高)大于玉米油(多不饱和脂肪酸比例较高)，但质构特性和持水力都是玉米油(多不饱和脂肪酸比例较高)大于橄榄油(单不饱和脂肪酸比例较高)，表明油脂在乳剂中的物理状态或者单和多不饱和脂肪酸的比例导致玉米油和橄榄油复合凝胶的流变性、质构特性和持水力的差异；电镜扫描显示了复合凝胶中油脂并不是单纯的填充在肌原纤维蛋白三维网络的空隙中，乳化的油脂与凝胶网络之间可能存在一些化学键上的作用力，可继续进行后一步研究确认。本试验探究了肌原纤维蛋白乳化后的油脂与其复合凝胶的结构特性，为鱼糜生产加工过程中需要加入的油脂类型和比例提供了一定的理论依据。