电针复合七氟烷麻醉干预断尾大鼠核c-fos蛋白表达的应激调控机制

彭昌梅,赵俊莺,王艳



电针复合七氟烷麻醉干预断尾大鼠核c-fos蛋白表达的应激调控机制

彭昌梅1,赵俊莺2,王艳3

(1.重庆开州光明骨科医院,重庆 405400;2.西安医学院第一附属医院,西安 710077;3.重庆医科大学附属第二医院,重庆 400010)

分析电针复合七氟烷麻醉干预断尾大鼠核c-fos蛋白表达的应激调控机制,为临床患者诊疗提供一些实验室依据。50只SPF级Wistar雄性大鼠,随机分为麻醉组、针刺组、观察组、对照组与正常组,每组10只。除正常组外,其他各组大鼠制备急性应激模型,麻醉组和观察组大鼠行七氟烷麻醉,针刺组和观察组大鼠行电针治疗,对照组和正常组大鼠不进行任何干预。采用ELISA法检测血清皮质酮(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)含量,Western blot检测大鼠下丘脑c-fos蛋白表达状况,流式细胞分析仪检测外周血T淋巴细胞亚群含量。与正常组比较,对照组大鼠血清CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表达上升(＜0.05);与对照组比较,针刺组、麻醉组及观察组大鼠CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表达下降(＜0.05);与针刺组、麻醉组比较,观察组大鼠血清CORT、ACTH含量和c-fos蛋白表达下降(＜0.05)。与正常组比较,对照组大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降(＜0.05);与对照组比较,针刺组和观察组大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升(＜0.05)。电针复合七氟烷麻醉可显著改善断尾大鼠机体应激状况,降低核c-fos蛋白分泌和血清ACTH、CORT含量,提升大鼠机体免疫功能。

针刺疗法;电针;应激;c-fos蛋白;大鼠

应激为机体对于不同刺激所形成的非特异性反应,一般经过下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴所产生应激激素来适应并调节应激反应[1-2]。血清皮质酮(CORT)与促肾上腺皮质激素(ACTH)含量为HPA调控应激反应的主要外周指标,而中枢调控应激敏感因子为c-fos蛋白。全身麻醉结合电针能够使肺切除患者在围手术期内应激反应下降,颈丛阻滞结合电针也可以使甲状腺患者在围手术期内应激反应下降[3-4]。因此,本研究经过分析电针复合七氟烷麻醉对断尾大鼠核c-fos蛋白分泌及应激调控机制,为临床患者诊疗提供一些实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠

SPF级Wistar雄性大鼠50只,6周龄,购自成都达硕实验动物有限公司,许可证号为[SCXK(川):2018- 23],体质量90～120 g,平均(113.51±12.39)g。常规饲养1周后开始实验,大鼠分笼饲养,每个笼内5只,室温维持在22℃～26℃,相对湿度在55%～65%,昼夜循环,保持12 h光照,大鼠添加饲料及换水等都由专人进行。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

SAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司), CORT、ACTH试剂盒(华美Cusabio公司),鼠抗b-actin (北京中杉金桥公司生产,1:1000),兔抗人多克隆c-fos抗体(美国Santa Cruz公司,1:1000),DAB(美国Sigma公司),山羊抗兔辣根标记二抗(美国Sigma公司, 1:5000)、山羊抗小鼠辣根标记二抗(美国Sigma公司, 1:5000)。

1.2.2 主要仪器

IPP6.0凝胶成像系统、麻醉气体监护仪(美国Datex-Ohmeda公司),华佗牌电子诊疗仪(苏州医疗用品厂,型号SDZ-Ⅱ),ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔特生物公司),七氟烷挥发罐、Bio-Rad电转膜仪及Bio- Rad蛋白电泳系统(美国Datex-Ohmeda公司)。

1.3 动物分组

采用随机数字表法将大鼠分为麻醉组(10只)、针刺组(10只)、观察组(10只)、对照组(10只)与正常组(10只)。

1.4 模型制备

除正常组外,其他各组大鼠依据Xu B等[5]方法使用低位尾干切断(ICTR)法制备急性应激模型,大鼠固定后,横切尾端尾干部位(即S3与S4脊髓神经间)。

1.5 干预方法

依据Lee HT等[6]实验方法,麻醉组和观察组大鼠通入七氟烷(体积分数为2%)。大鼠置入玻璃麻醉箱内,石灰铺满箱底,七氟烷使用Ohmeda挥发罐给予麻醉诱导与麻醉维持,气管导管接至Datex麻醉气体监护仪上,对呼气末七氟烷含量监测,玻璃箱内保持七氟烷含量在2%。同时对针刺组和观察组大鼠行电针,在大鼠翻正反射消失以后,快速从麻醉箱内取出,电针连接后再放入麻醉箱内。依据《实验针灸学》[7]选取足三里所对应后三里,在膝关节外侧的腓骨小头下缘5 mm位置胫腓骨之间,直刺7 mm,行疏密波,参数为3 Hz、3 V、 2 ms,电针刺激每30 min进行1次,间隔30 min进行,共行4次。对照组和正常组大鼠不进行任何干预。大鼠在末次刺激后断颈处死,取外周血6 mL,同时取下丘脑组织保存于液氮内。

1.6 观察指标

1.6.1 血清CORT、ACTH含量

各组大鼠外周血加入到抗凝管内,室温放置2 h, 4000 r/min离心10 min后取上清液,ELISA法检测血清CORT、ACTH含量,标准品稀释后加入至酶标板标准品孔内,样品加入到样品孔内,每个孔内10mL,胶纸将反应孔封住,37℃下孵育2 h,洗板5次,再加入10mL生物素化抗体工作液,37℃下孵育1 h,洗板5次,加入10mL酶结合物工作液,37℃下避光孵育30 min,洗板5次,每孔加入10mL显色液,37℃下避光孵育20 min,最后加入终止液,混匀后检测OD450数值,标准品浓度当做横坐标,OD数值当做纵坐标,绘制标准曲线,依据样品OD数值于标准曲线内查看其浓度。

1.6.2 大鼠下丘脑c-fos蛋白表达

采用Western blot检测,下丘脑加入比例为5mg/mL组织裂解液,匀浆以后离心机13000 r/min离心后选取上清液检测其总蛋白含量。选取蛋白质40mg,加热变性,蛋白采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,凝胶内蛋白质采用电转膜仪至聚二偏氟乙烯膜内,Tris缓冲液(含有0.1%Tween-20及10%脱脂奶粉)封闭1 h,而后行免疫杂交反应。兔来源c-fos抗体1:1000加入,在4℃下孵育过夜。Tris缓冲液洗涤以后将羊抗兔二抗加入,滴度是1:5000,在室温下孵育78 min。Tris缓冲液洗涤,暗室下降增强化学发光剂加入,压X线片。Western杂交膜将c-fos条带显示以后,PVDF膜使用Tris缓冲液洗涤30 min,b-actin条带使用同样方法显示,当做加样内参照。X线片内条带在经过凝胶成像系统将灰度值读取,定量。c-fos/b-actin条带灰度数值对上样量偏差进行纠正, c-fos蛋白含量使用灰度比值表示。

1.6.3 T淋巴细胞亚群(CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢)含量

取大鼠外周血5 mL,抗凝后加入对应荧光MoAb 10mL,避光放置20 min。再加入2 mL裂解液,摇匀后避光放置10 min,红细胞全部裂解后离心机1200 r/min离心6 min,PBS洗涤3次后采用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群(CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢)含量。

1.7 统计学方法

使用SPSS19.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用独立样本检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清CORT、ACTH含量比较

与正常组比较,对照组大鼠血清CORT、ACTH含量上升(＜0.05);与对照组比较,针刺组、麻醉组及观察组大鼠CORT、ACTH含量下降(＜0.05);与针刺组、麻醉组比较,观察组大鼠血清COPR、ACTH含量下降(＜0.05)。详见图1。

注:与正常组比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05;与麻醉组比较3)P＜0.05;与针刺组比较4)P＜0.05

2.2 各组大鼠下丘脑c-fos蛋白表达比较

与正常组比较,对照组大鼠下丘脑c-fos蛋白表达上升(＜0.05);与对照组比较,针刺组、麻醉组及观察组大鼠下丘脑c-fos蛋白表达下降(＜0.05);与针刺组、麻醉组比较,观察组大鼠下丘脑c-fos蛋白表达下降(＜0.05)。详见图2-3。

图2 各组大鼠下丘脑c-fos蛋白表达比较

注:与正常组比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05;与麻醉组比较3)P＜0.05;与针刺组比较4)P＜0.05

2.3 各组大鼠外周血清T淋巴细胞亚群含量比较

与正常组比较,对照组大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降(＜0.05);与对照组比较,针刺组和观察组大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升(＜0.05)。详见图4。

注:与正常组比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05

3 讨论

急性应激一方面经过交感神经兴奋,释放儿茶酚胺类物质,可造成外周血内血糖、CORT及ACTH等快速上升,另一方面可经过伤害性感受器刺激各种炎性介质释放,如P物质、组胺、缓激肽及前泪腺激素等,同时激活多种体液级联系统,抑制或者阻碍上述通路就可有效降低其应激强度。临床一般将机体神经元兴奋标志视为c-fos蛋白表达状况,若机体处于非应激状况,其脑部c-fos蛋白的表达含量非常低[8-9]。张云东等[10]研究显示,机体受到创伤前期应激状况下下丘脑内c-fos表达量迅速升高,而促肾上腺素释放激素(CRH)表达则比c-fos表达略慢,这说明在机体创伤以后应激反应下其下丘脑内前期c-fos表达对CRH基因表达有激活影响。相关研究显示,传入急性疼痛应激以后,下丘脑室旁核的c-fos mRNA转录被激活,c-fos蛋白表达,导致下丘脑释放大量CRH到垂体内并进入血中,进而使HPA轴启动[11-14]。

本研究显示,观察组和对照组大鼠进行断尾急性刺激以后,其血清内CORT、ACTH含量快速上升,同时下丘脑内c-fos表达量也上升,说明急性应激模型成功制备,而后对观察组大鼠行七氟烷吸入联合电针刺激,其下丘脑内c-fos表达量下降,其作用机制可能为电针结合七氟烷可降低大鼠下丘脑内激活c-fos神经元,那么转录形成CRH数量也同样降低。HPA轴被CRH激活后所释放到血清内ACTH含量下降,肾上腺皮质受ACTH刺激所形成的CORT含量也随之下降,交感神经兴奋通路抑制和伤害性感受器刺激各种炎性介质释放数量降低,从而起到降低应激强度作用,患者应激状况得以调节。相关研究显示,对神门、百会等穴位行电针刺激可使血清内ACTH、CORT含量降低,其影响原理可能和电针对HPA轴功能调节有联系,另外,临床神经外科手术中采用电针复合七氟烷麻醉也证明了其对患者术后前期恢复与镇痛效果理想[15-16]。本研究显示,观察组大鼠在进行电针和七氟烷麻醉影响后,其血清内CORT、ACTH含量明显降低,说明七氟烷吸入麻醉结合电针调控应激影响有效,同时观察组大鼠下丘脑组织内c-fos表达量下降也验证了HPA轴受下丘脑调控作用和c-fos表达量降低有紧密联系。交感肾上腺素受兴奋迷走胆碱能神经纤维抑制,对激素含量改变有调整影响;同时还能够将镇痛机制激活,痛觉信号传递受到抑制,进而起到镇痛影响,使患者疼痛所诱发应激反应下降[17-19]。机体应激状态可经过体液系统、神经系统改变并影响机体免疫系统识别力,降低免疫功能。Keller T等[20]利用强度电刺激当做应激因子,发现应激可降低外周血内淋巴细胞数目,血清内淋巴细胞转化受到抑制,其抑制效应和应激强度成正比。T淋巴细胞为机体免疫功能最重要免疫细胞,其中CD3﹢反映了总T淋巴细胞水平,而CD4﹢、CD8﹢和CD4﹢/CD8﹢在一定程度内可表示辅助性T淋巴细胞和抑制性T淋巴细胞及其比值。本文研究显示,与正常组比较,对照组大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量下降;与对照组比较,针刺组和观察组大鼠血清CD3﹢、CD4﹢、CD8﹢及CD4﹢/CD8﹢含量上升,差异均具有统计学意义(＜0.05),说明在应激状态下大鼠免疫功能受到抑制,而针刺可有效改善大鼠因应激所造成免疫功能抑制。

综上所述,电针复合七氟烷麻醉可显著改善断尾大鼠机体应激状况,降低核c-fos蛋白分泌和血清ACTH、CORT含量,提升大鼠机体免疫功能。

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Stress-regulation Mechanism of Electroacupuncture plus Sevoflurane Anesthesia via Intervening Nuclear C-fos Protein Expression in Caudal Resection Rats

-1,-2,3.

1.,405400,; 2.’,’710077,; 3.,400010,

To analyze the stress-regulation mechanism of electroacupuncture plus sevoflurane anesthesia via intervening nuclear C-fos protein expression in caudal resection rats, and to provide laboratory evidence for the diagnosis and treatment in clinical practice.Fifty SPF-grade male Wistar rats were randomized into an anesthesia group, an acupuncture group, an observation group, a control group and a normal group, with 10 rats in each group. The rats were established into acute stress models except those in the normal group. Rats in the anesthesia group and observation group received sevoflurane anesthesia, the acupuncture group and observation group received electroacupuncture, and the control and normal groups did not receive any intervention. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of corticosterone (CORT) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) in serum; Western blot was adopted to examine the protein expression of C-fos in hypothalamus; flow cytometry apparatus was used to detect the T-lymphocyte subsets in peripheral blood.Compared with the normal group, the contents of CORT and ACTH in rat’s serum and the protein expression of C-fos increased in the control group (＜0.05); compared with the control group, the contents of CORT and ACTH and the protein expression of C-fos in the acupuncture group, anesthesia group and observation group decreased (＜0.05); compared with the acupuncture and anesthesia groups, the contents of CORT and ACTH in rat’s serum and the protein expression of C-fos declined in the observation group (＜0.05). Compared with the normal group, the contents of CD3﹢, CD4﹢, CD8﹢and CD4﹢/CD8﹢in serum declined in the control group (＜0.05); compared with the control group, the contents of serum CD3﹢, CD4﹢, CD8﹢and CD4﹢/CD8﹢increased in the acupuncture and observation groups (＜0.05).Electroacupunc- ture plus sevoflurane can significantly improve the stress state in caudal resection rats, down-regulate the secretion of nuclear C-fos protein and the contents of serum ACTH and CORT, and enhance the rat’s immune function.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Stress; C-fos protein; Rats

1005-0957(2019)05-0560-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.05.0560

2018-12-29

彭昌梅(1978—)女,主治医师,Email:seainglong23@163.com