延时摄像技术的胚胎动力学参数与妊娠结局的关系

张璨，胡艳秋，佘宏，陈芳

1997年，Payne等[1]第一次通过延时摄像技术对 接受胞浆内单精子注射（ICSI）的胚胎发育进行观测。该技术将光学显微系统与培养箱相整合，可在设定的时间间隔内对胚胎进行图像采集，实现图像化确认及数据化保存，并且可保持培养箱内环境的稳定[2]。延时摄像系统也可以监测到胚胎发育过程中的异常分裂事件。近年研究证实一些传统培养模式下无法发现的胚胎发育特征会导致人类胚胎发育和植入潜力降低[3-5]。近年来，众多研究力图寻找不同参数与囊胚形成、胚胎着床潜能、活产之间的关系，建立胚胎选择模型，从而优化胚胎选择、降低多胎率。但到目前为止，各中心建立的参数模型无法达成统一[6-9]。本研究旨在探讨延时摄像系统动力学参数与妊娠结局的关系，并初步建立适用于苏北人民医院生殖中心（我中心）的优胚选择模型。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年12月—2017年12月在我中心接受体外受精（IVF）/ICSI-胚胎移植（ET）的137个延时摄像系统培养周期进行回顾性分析。纳入标准：女性年龄20～44岁；体质量指数（BMI）≤30 kg/m2；不孕时间≥1年；获卵数≥1个。排除标准：子宫异常（子宫肌瘤、子宫腺肌病、其他先天或后天性子宫畸形）；子宫内膜异位症Ⅲ期或Ⅳ期；患者或其配偶染色体异常；供卵/冻卵周期；习惯性流产；补救ICSI。本研究获得苏北人民医院伦理委员会批准（审批文号：2018KY-104）。

1.2 治疗方案 长方案：前次月经周期的黄体中期开始使用促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）降调节，包括短效制剂曲普瑞林（达必佳，辉凌制药有限公司，德国）和长效曲普瑞林（达菲林，博福-益普生制药有限公司，天津）。于月经第3天开始使用促卵泡生长激素，包括卵泡刺激素（FSH）和人绝经期促性腺激素（HMG，丽珠集团丽珠制药厂，75 IU/支），其中FSH有重组人FSH（rFSH，果纳芬，默克雪兰诺有限公司，瑞士）和尿源性FSH（uFSH，丽申宝，丽珠集团丽珠制药厂）2类。根据经阴道B型超声（B超）监测卵泡发育情况及检测的血清内分泌情况调整促性腺激素（Gn）用量。

拮抗剂方案：促排卵药物选用rFSH或HMG，在月经来潮第3天开始促排卵，最大卵泡直径≥12 mm时加用促性腺激素释放激素拮抗剂（GnRHA，思则凯，德国Baxter Oncology GmbH公司）0.25 mg/d，促排期间监测卵泡发育情况及激素水平调整用量。微刺激方案：月经第3天开始给予枸橼酸氯米芬胶囊（塞浦路斯高特制药，法地兰）50 mg/d，5 d后阴道B超观察卵泡大小、数目及子宫内膜情况，月经第5天开始每日给予HMG，根据阴道B超检测卵泡发育情况以及激素水平调整用量。

当B超监测下至少有1个优势卵泡平均直径达18 mm以上时，于当晚注射8 000～10 000 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG，丽珠集团丽珠制药厂），36 h后在超声引导下经阴道穿刺取卵。

1.3 胚胎体外培养 将正常受精胚胎转移至卵裂培养滴并置于ASTEC观察系统（CCM-iBIS，日本），37℃、6%CO2条件下培养。延时摄像系统设定的图像捕获频率为每15 min采集一次图像，连续采集2～3 d，记录胚胎发育过程的时间参数及异常事件。将原核消失的时间（tPDf）计为起始时间[10]。记录时间参数：原核消失到2-细胞阶段的时间（t2）（同理t3、t4、t5、t6、t7、t8）、2-细胞发育为3-细胞的间隔时间（cc2）、3-细胞发育为4-细胞的间隔时间（s2）、4-细胞发育为5-细胞的间隔时间（cc3）、5-细胞发育为8-细胞的间隔时间（s3）。采用我中心常规胚胎形态学评估方法对胚胎进行分级。

1.4 观察指标 胚胎移植后14 d测定血清β-hCG水平，阳性者于移植后28～35 d行阴道超声检查，以观测到孕囊确定为临床妊娠。相关临床结局指标如下：胚胎着床率=（着床胚胎数/移植胚胎数）×100%，囊胚形成率=（形成囊胚数/培养胚胎数）×100%，优质囊胚形成率=（优质囊胚数/培养胚胎数）×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。首先采用Shapiro-Wilk检验对定量资料进行正态性分析，正态分布数据用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，非正态分布数据用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；定性资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。运用Logistic回归分析动力学参数与胚胎着床的相关性，建立受试者工作特征（ROC）曲线对选胚模型进行验证。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胚胎异常分裂事件 在移植或冷冻的648枚胚胎中，有171枚存在早期异常分裂事件，包括直接分裂：1-细胞直接分裂为3-细胞（n=7）、cc2＜5 h（n=152）；逆分裂：在完成分裂后两个卵裂球重新融合或者未完全分裂的卵裂球最终融合（n=12），异常分裂率分别为4.1%、88.9%、7.0%。其中有16枚被认为是可移植胚胎并进行了鲜胚或冻融胚胎移植（2枚胚胎发生直接分裂事件，14枚胚胎cc2＜5 h），只有4枚着床，可将胚胎异常分裂作为选胚排除标准。

2.2 延时摄像系统中着床与未着床胚胎的时间参数比较 延时系统组共有132枚胚胎进行了鲜胚或冻融移植并已知妊娠结局，排除异常分裂及部分参数信息缺失的胚胎，剩余已知妊娠结局的胚胎中孕囊数等于移植数的共有31枚（23个移植周期），均未着床的有53枚（30个移植周期）。着床周期与未着床周期女性年龄、BMI、不孕时间、FSH、雌二醇（E2）、黄体生成激素（LH）、促排卵方案、授精方式、Gn用量、子宫内膜厚度、获卵数、正常受精数和卵裂胚胎数差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。延时摄像系统中着床胚胎与未着床胚胎t2～t8、cc2、s2、cc3、s3共11个时间参数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 胚胎动力学参数对妊娠结局的预测意义 根据纳入的84枚胚胎各动力学参数的四分位点将参数的分布范围分为4个时间区间，并分别计算每个区间内胚胎着床率（如表3所示），将着床率最高的区间定义为最佳区间（如表中加粗斜体所示），并将最佳区间内及最佳区间外的胚胎着床率进行比较，得出t6、t7、t8、cc2最佳区间内外的胚胎着床率差异有统计学意义（54.2%vs.30.0%，P=0.038；58.6%vs.25.5%，P=0.003；53.6%vs.28.6%，P=0.025；61.9%vs.28.6%，P=0.006），对胚胎着床有预测价值。

表1 着床周期与未着床周期基本信息比较

表2 延时摄像系统中着床与未着床胚胎的时间参数比较[h，M（P25，P75）]

2.4 建立胚胎着床预测模型 运用Logistic回归分析与胚胎着床潜能相关的时间参数，发现t6（OR=1.462，95%CI：1.093～1.954，P=0.010）、t7（OR=0.803，95%CI：0.653～0.989，P=0.039）为最佳预测因子。

结合t6、t7的最佳区间，同时将胚胎异常分裂为选胚排除标准，建立我中心胚胎着床预测模型，将胚胎分为A、B、C、D、E共5个等级。若胚胎发育过程中出现异常卵裂事件，则评为E级；未出现异常分裂事件的胚胎若t6、t7均在最佳区间，则评为A级；若满足t7最佳区间而处于t6最佳区间外，则评为B级；若满足t6最佳区间而处于t7最佳区间外，则评为C级；若t6、t7均处于最佳区间外，则评为D级。发现随着等级的下降，胚胎着床率也逐步下降：A级为75.0%（9/12）、B级为42.9%（6/14）、C级为28.6%（6/21）、D级为27.0%（10/37）、E级为25.0%（4/16），组间差异有统计学意义（P=0.034）。

对该预测模型进行诊断验证，建立ROC曲线分析该模型对胚胎着床的预测能力，结果显示ROC曲线下面积（AUC）为0.649（95%CI：0.528～0.770）。

2.5 胚胎着床预测模型在囊胚形成中的验证 排除于延时系统中部分参数信息缺失的胚胎，剩余共培养胚胎181枚，最终形成囊胚132枚，其中优质囊胚68枚。按胚胎着床预测模型将囊胚分成A、B、C、D、E 5个等级，其囊胚形成率及优质囊胚形成率均随等级下降逐渐降低（P＜0.05）。见表4。

表3 各动力学参数按四分位法分组（Q1、Q2、Q3、Q4）

表4 囊胚在胚胎着床预测模型下的分级及优质囊胚率

3 讨论

随着延时摄像系统在辅助生殖领域的广泛应用，胚胎学家正致力于寻找与胚胎发育潜能及妊娠结局相关的动力学参数[11-14]。本研究通过对胚胎着床数据进行分析，探讨延时摄像系统动力学参数与妊娠结局的关系。

延时摄像系统可捕捉到胚胎早期发育过程中异常分裂事件的发生，从而为胚胎评估及筛选提供新的方向。既往多项研究表明，胚胎发育过程中直接分裂及逆分裂现象可影响胚胎发育，导致胚胎植入能力降低[15-16]。因此，本研究建立胚胎着床预测模型时主要将延时摄像系统中存在直接分裂及逆分裂现象的胚胎作为选胚排除标准。本研究发现在延时系统组，648枚胚胎中有171枚存在异常分裂事件，包括直接分裂及逆分裂，其中有16枚行鲜胚或冻融胚胎移植，4枚着床，将胚胎异常分裂纳入选胚排除模型，计为等级E。胚胎学家对异常分裂胚胎能否活产提出不同意见。Aguilar等[17]和Balakier等[18]关于多核化的研究表明，胚胎早期卵裂过程中的多核化可在发育过程中自行矫正，对妊娠结局没有影响。2016年Fan等[19]研究分析了异常分裂胚胎的发生率，并根据活产数据确定哪些类型的异常分裂胚胎可能适合移植，发现异常分裂胚胎能够活产，且t5～t8可以作为预测胚胎发育潜能的最佳参数指标。本研究有4枚直接分裂胚胎在移植后着床，但未进一步跟踪远期妊娠结局，无法支持该结论。异常分裂胚胎能否同正常发育胚胎一样获得活产，其内在发生机制及成功着床机制仍需深入探讨。

既往大部分研究均以胚胎受精时间作为延时参数的起始时间，但在实际运用中，已有的延时摄像系统很难将受精时间精确化，且已有研究证明，在IVF/ICSI中将原核消失时间替代受精时间可减少早期卵裂时间上的不一致[10]。本研究将tPNF作为起始时间，比较了着床与未着床胚胎t2～t8、cc、s2、cc3、s3共11个时间参数，运用四分位法将各时间参数分为4个时间区间，筛选出最佳区间，结果表明t6、t7、t8、cc2这4个动力学参数最佳区间内的胚胎着床率优于最佳区间外的胚胎着床率，其最佳区间对胚胎着床有预测意义。许多研究表明胚胎发育的早期参数在整个胚胎发育过程中至关重要，如原核形成及消失时间、第一次分裂时间、3-细胞到4-细胞时间等与囊胚形成或胚胎着床有关，且分裂时间相对较早的胚胎更有机会发育成囊胚[20-23]。本研究并未得到胚胎早期发育参数与着床率的显著性关系，考虑是由于本研究以原核消失时间作为起始计数时间，这可能导致与其他实验中心的研究结果存在差异。

迄今为止尚无统一的胚胎选择标准，本研究最终目的是初步建立适用于我中心的优胚选择模型。为此，采用Logistic回归分析从11个动力学参数中找到与胚胎着床密切相关的t6和t7，这与四分位法获得的结果相吻合，将t6、t7的最佳区间与异常分裂事件结合，初步建立了选胚模型，并对此模型做出验证，结果证明胚胎着床率随胚胎等级的下降而逐渐降低。但本研究存在局限性，AUC仅为0.649，可能是因为纳入模型中的胚胎样本量相对较少，并且缺少更多新的胚胎着床数据来验证模型的预测能力，仍需进一步扩大样本量来验证。此外，本研究将胚胎着床预测模型应用于囊胚培养中，发现优质囊胚形成率随胚胎等级的下降而降低，这与胚胎着床率的结果相符合，胚胎着床预测模型对于优质囊胚的预测也存在一定的参考价值，但这仍需大样本数据的进一步验证。

近年各种筛查技术如胚胎植入前的基因筛选、代谢组学、蛋白质组学等也正在被评估能否用来确定发育潜力最高的胚胎，与延时摄像技术一样，这些技术都存在各自的利弊[24-26]。从长远角度来讲，建议应当评估如何让各种技术相辅相成，进一步优化辅助生殖技术中对于优质胚胎的选择。