自体血清体外成熟培养液卵胞浆优化在首次ICSI治疗中的应用

纪冬梅，章志国，邹薇薇，邓晓红，陈蓓丽，周平，魏兆莲，曹云霞

近年体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）技术不断发展，控制性超促排卵的方案、药物、胚胎培养的体系等各个环节的不断更新、改善，IVF的成功率也在逐渐提高[1]。控制性超促排卵时获得更多高质量的卵子是提高IVFET累积成功率的关键因素之一。到目前为止，任何一种促排卵方案都无法保证所获卵子均是成熟卵子，甚至是卵胞核与胞质均成熟的卵子。超排卵导致卵子核质发育不同步，直接影响胚胎质量和妊娠结局，卵胞浆成熟不完全可能是IVF临床结局差的原因之一[2-4]。提高卵母细胞成熟的核质同步化，是决定胚胎质量的重要因素之一。本研究利用自体血清配制的体外成熟（in vitro maturation，IVM）培养液在胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）前将卵子培养2～4 h进行卵胞浆优化，与常规受精培养液培养的临床结局进行比较，探讨ICSI周期常规使用IVM液进行授精前短时培养卵胞浆优化的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年1月—2018年7月在安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心（我中心）首次行ICSI助孕的不孕症患者共1 074例，根据取卵日有无采用自体血清配制的IVM液培养将患者设为血培组（819例）和非血培组（255例）。血培组取卵后IVM培养2～4 h行ICSI授精，非血培组取卵后在常规受精液中培养2～4 h行ICSI授精。本项目所有血培患者均签署自体血清体外成熟培养液应用知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性超促排卵 患者接受我中心常规IVF-ET术前检查，采用标准长方案或拮抗剂方案促排卵。①长方案促排卵：实施助孕前黄体中期使用长效促性腺激素激动剂（GnRHa，达菲林，3.75 mg/支，法国益普生生物制药公司）0.9～1.9 mg，行垂体降调节。降调节后2周复查血卵泡刺激素（FSH）、黄体生成激素（LH）、雌二醇（E2），当达到垂体完全降调节（FSH＜5 mIU/mL，LH＜5 mIU/mL，E2＜50 pg/mL），开始使用外源性促性腺激素（Gn）150～225 IU促排卵，Gn包括注射用人重组卵泡刺激素（果纳芬，75 IU/支，瑞士默克雪兰诺有限公司）、重组促卵泡素β注射液（普利康，50 IU/支或100 IU/支，美国默沙东有限公司）、注射用尿促卵泡素（丽申宝，75 IU/支，中国丽珠集团丽珠制药厂）、注射用尿促性素（乐宝得，75 IU/瓶，中国丽珠集团丽珠制药厂），期间监测卵泡生长及血清性激素水平，必要时调整Gn用量。②拮抗剂方案促排卵：月经第2～3天开始，每天给予外源性Gn 150～225 IU促排卵治疗；当卵泡直径达到14 mm或血LH水平超过5 mIU/mL时给予GnRH拮抗剂（GnRHA，注射用醋酸西曲瑞克，思则凯，0.25 mg/支，瑞士默克雪兰诺有限公司）0.25 mg/d皮下注射。当2个优势卵泡直径达到18～20 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）10 000 IU（5 000 IU/支，中国丽珠集团丽珠制药厂）或注射用重组hCG 250 μg（艾泽，250 μg/支，瑞士默克雪兰诺有限公司），34～36 h后行阴道B超引导穿刺取卵。

1.2.2 取卵与自体血清IVM液培养 于hCG注射次日上午抽取患者外周血5 mL，离心后提取1 mL血清用于配制5 mL IVM液。IVM培养液配置：80%Medium 199＋2.2 mg/mL丙酮酸＋0.075 IU/mL FSH＋0.5 IU/mL hCG＋0.8 μg/mL雌激素＋5～10 μmol褪黑素＋6.0 mg/mL双抗＋20%自体血清。0.22 μm滤器过滤后在培养皿（Falcon 353037）的中央孔放500 μL，盖矿物油，剩余液放外围，并置于37℃、6%CO2培养箱内平衡过夜。注射hCG 10 000 IU后34～36 h行B超引导下经阴道穿刺取卵术。在含有2 mL Gamete的培养皿中挑出卵冠丘复合物，切去血块和过多的颗粒细胞后将卵冠丘复合物移到IVM液（血培组）或Fertilization液（非血培组）中培养2～4 h行ICSI。

1.2.3 IVF-ET ICSI前将卵母细胞置于含200 μL透明质酸酶的四孔皿中，用巴斯德吸管反复吹吸，拆去卵母细胞周围的大部分颗粒细胞，再将其移入含500 μL Gamete液四孔皿，用155 μm拆颗粒针（stripper，Origo）反复吹吸至不含或仅含少量颗粒细胞，将成熟MⅡ卵子行ICSI授精，然后置于37℃，5%CO2、5%O2、90%N2培养箱培养。未成熟卵子经患者知情同意后丢弃或继续在自体血清IVM液培养。授精后16～18 h在倒置显微镜下观察检查受精情况并记录，正常受精者继续体外培养至取卵后第5～7天，行新鲜胚胎移植和（或）胚胎冷冻。

1.2.4 妊娠评估 新鲜或解冻胚胎移植后11 d检测血或尿hCG，阳性者于移植后30 d行阴道超声检查，见宫内孕囊或异位妊娠确定为临床妊娠，如宫内孕囊中可见胚芽、且原始心管搏动正常则继续黄体支持至胚胎移植后65 d。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析。定量资料符合正态分布的数据用均数±标准差（）表示，组间比较用独立样本t检验；不符合正态分布的数据用中位数（百分位数）[M（P25，P75）]表示，组间比较用两独立样本Mann-Whitney检验。定性资料用百分率表示，组间比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者一般情况比较 2组患者的年龄、不孕时间、体质量指数（BMI）、基础FSH和基础LH水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 2组患者一般情况比较 （）

表1 2组患者一般情况比较 （）

基础LH（IU/L）血培组 819 29.82±4.80 3.83±2.81 22.43±2.97 7.38±2.21 5.30±3.62非血培组 255 30.38±4.86 3.89±2.49 22.26±2.93 7.52±2.34 5.53±3.58 t或Z -1.629 -0.325 0.762 -0.883 -0.895 P 0.104 0.745 0.446 0.378 0.371组别 n 年龄（岁）不孕时间（年）BMI（kg/m2）基础FSH（IU/L）

2.2 2组患者促排卵及胚胎发育情况比较 血培组患者的获卵数、受精率、囊胚形成率稍高于非血培组患者，非血培组的优质囊胚率稍高于血培组，但是差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

2.3 新鲜移植周期2组患者临床结局比较 血培组中47例、非血培组中22例行新鲜周期胚胎移植。2组患者新鲜移植周期的年龄、基础FSH水平、hCG日子宫内膜厚度和移植胚胎数比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。2组均有因未受精、未卵裂或未获得囊胚而取消周期的患者，2组患者新鲜移植周期的周期取消率差异无统计学意义（P=0.119）。血培组新鲜移植中32例获得临床妊娠，2例发生流产，至随访截止，共21例活产，9例继续妊娠中，共30例。非血培组新鲜移植中11例获得临床妊娠，3例发生流产，1例异位妊娠，至随访截止，共2例获得活产，5例继续妊娠中。2组患者新鲜移植周期的临床妊娠率和胚胎种植率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。血培组流产率低于非血培组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

3 讨论

IVF技术的关键步骤之一控制性超促排卵可获得比自然周期更多的卵子，但是并非所有卵子都具有相同的发育潜力，这可能主要取决于卵子的细胞核与细胞质的质量以及成熟的同步性。目前临床上判断卵子成熟的主要标志就是第一极体（first polar body，PB1）的排出。但是实际上，从PB1开始排出时细胞质的分离到细胞核中染色体的完全分离，第一次减数分裂完成需要数个小时不等[5]。近期一项研究关于卵子成熟率与ICSI结局的关系发现，卵子成熟率低于30%组的卵子受精率、胚胎发育率、种植率及临床妊娠率均低于卵子成熟率大于30%组，提示卵子成熟度低的患者临床结局差[6]。在卵母细胞成熟过程中，虽然细胞核成熟比细胞质的成熟要容易，但细胞质成熟在后续的胚胎发育中发挥更为重要的作用。然而，细胞质影响胚胎发育潜能的具体机制尚不清楚[7]。相关研究表明胞质欠成熟可能会导致合子基因组激活失败，从而影响IVM结局[8-9]。

表2 2组患者促排卵及胚胎发育情况比较

表3 新鲜移植周期2组患者临床结局比较

应用促排卵药物募集到的大部分卵母细胞在取卵前快速发育，此时的卵母细胞可能处于GV期（生发泡期）、MⅠ期（生发泡消失，PB1未排出）或MⅡ（PB1排出）期，即使同为MⅡ卵子，也可能由于细胞核质发育不同步而影响卵母细胞受精和胚胎体外发育潜能[5]。本研究主要目的是研究常规的IVM液于ICSI前短期培养能否改善卵核质同步发育，从而改善胚胎发育和妊娠结局。

自1983年Veeck等[10]首次报道利用IVM技术将未成熟卵母细胞体外培养成熟并成功诞生一正常婴儿以来，目前IVM技术已成为IVF-ET领域的一项重要技术。我中心从2005年以来一直致力于卵子IVM相关研究，从早期添加人卵泡液、血清替代品到后续添加自体人血清以及褪黑素等抗氧化物质[11-14]，证实本中心自主研发的自体血清IVM液能够促进IVM卵子的胞质成熟、改善IVM卵子质量、胚胎发育和妊娠结局。

既往研究报道卵子取出后体外培养2～4 h可显著提高卵子的成熟率、受精率和胚胎质量[15]。最近也有研究发现取卵后2 h内拆除颗粒细胞并不影响ICSI周期的受精、胚胎植入、临床妊娠、活产等临床结局[16]，可能由于该研究纳入ICSI周期的卵子成熟率均较高。本研究将取出的卵冠丘复合物分别在自体血清IVM液（血培组819例）和常规受精液（非血培组255例）中培养2～4 h进行卵子胞浆优化再行ICSI授精，血培组的卵子成熟率、受精率、囊胚形成率高于非血培组患者，非血培组的优质囊胚率稍高于血培组，差异均无统计学意义，表明自体血清IVM液培养可获得与常规受精液培养相似的受精和胚胎发育结局，虽然没有明显改善卵子成熟率和胚胎发育，但是自体血清IVM液还可以用于未成熟卵子的继续体外培养，增加累积卵子成熟率和妊娠率[13-14]。血培组的临床妊娠率、胚胎种植率均高于非血培组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；血培组的流产率低于非血培组，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明自体血清IVM液可显著降低流产率，提高活产/继续妊娠率。以上研究结果可能与IVM液优化了卵胞质成熟，提高了胚胎发育潜能有关，仍需要加大样本量继续深入研究作用的机制。

综上，本中心的自体血清IVM液用于ICSI患者卵子授精前短时培养，不仅有望改善妊娠结局，还能继续用于未成熟卵的体外培养，值得在临床推广使用。