红景天苷对子宫内膜上皮细胞的抗炎和保护作用Δ

祝 琴，范文勇，杜丽艳

(深圳市宝安区人民医院妇产科，广东 深圳 518101)

在正常情况下，女性阴道呈酸性环境，宫颈有黏液栓，构成生理屏障，可抵御细菌的侵入。但在特殊情况下，如经期、分娩、流产后及各种宫腔操作时，屏障作用减弱甚至消失，易发生细菌侵入，引起子宫内膜炎。急性子宫内膜炎可进一步发展为子宫肌炎、输卵管炎及盆腔炎，导致病情加重。子宫炎症的治疗主要以抗菌药物治疗和洗液外用为主，治疗手法单一，但效果因人而异。现存最早的中药学专著《神农本草经》将红景天列为药中上品，服用后可轻身益气，不老延年，无毒多服，久服不伤人；能补肾，理气养血，主治周身乏力、胸闷等。《西藏常用中草药》中认为，红景天还具有活血止血、清肺止咳、解热和止带下的功效[1]。由此可见，红景天可从“补益”“抗炎”两方面对子宫内膜炎起到修复和控制的作用。目前，该药主要用于心血管疾病的治疗[2-4]，在妇科疾病中的应用鲜有提及，其疗效显著但缺乏相关实验数据支持，限制了其应用范围。本研究前瞻性探讨了红景天重要提取物红景天苷对子宫内膜上皮细胞内毒素(LPS)刺激模拟的子宫内膜炎模型细胞的保护作用及抗炎作用，现报告如下。

1 材料

1.1 细胞株

子宫内膜上皮细胞株(南方医科大学实验室提供)。

1.2 药品与试剂

红景天苷(美国Sigma公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，美国Corning公司)，胰蛋白酶(美国Corning公司)，细胞角蛋白(CK)，抗体(美国Abcam公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(Tritonx-100，北京Solarbio公司)，LPS(美国Sigma公司)。

1.3 试剂盒与仪器

噻唑蓝(MTT)试剂盒(上海伯奥生物制品公司)，酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(美国RB公司)，1640培养基(美国RPM公司)，力康HeaLForceB2型生物安全柜(上海力新仪器有限公司)，HeaL Force HF90 CO2型培养箱(上海力新仪器有限公司)，96 孔培养板(美国Costar公司)。

2 方法

2.1 细胞培养

提前30 min高压灭菌相关器械，如玻璃皿、剪刀和镊子等；移液器及吸头采用紫外线照射30 min消毒。将子宫内膜上皮细胞株采用PBS组织液清洗3遍，加入10%胎牛血清培养液2 ml，剪碎至1 mm3大小，成糊状，800 r/min离心5 min；加入PBS漂洗1遍，离心5 min；加入组织量为2～3倍的复合酶，于37 ℃环境下消化，每15 min终止1次，加入等量的胎牛血清培养液终止；混合液采用80目筛网过滤，滤去大块组织，滤液离心600 r/min，重复离心2～3次，收集沉淀，接种于细胞培养瓶中于37 ℃、5%饱和湿度的5% CO2型培养箱中培养2 h；将生长良好的子宫内膜上皮细胞采用0.25%的胰蛋白酶消化4～5 min后，将悬浮在培养壁上的细胞轻轻吹打，使其成为悬浮液；去除仍旧贴于培养壁的细胞及悬液，700 r/min离心5 min，按105个/ml接种于96孔培养板中。

2.2 LPS的制备

将LPS溶液1 ml充分震荡溶解，采用0.22 μm滤膜正压过滤除菌分装，以质量浓度为1 mg/ml的LPS作为母液，采用1640培养基稀释，稀释比例为1 ∶ 1 000，最终质量浓度为1 μg/ml。

2.3 LPS激活内膜上皮细胞

96孔培养板中，每孔先加入含10%胎牛血清的1640培养基60 μl，然后接种细胞悬液100 μl，分为空白对照组，正常对照组，红景天苷低(1×10-9mol/L)、中(1×10-6mol/L)及高(1×10-3mol/L)剂量组，每组设8个复孔。37 ℃培养过夜后，空白对照组各孔给予PBS 20 μl；其他组各孔给予25 μg/ml的LPS 20 μl，空白对照组和正常对照组各孔给予1640培养基20 μl对照研究，红景天苷组各孔给予红景天苷20 μl处理。

2.4 增殖水平检测

LPS激活内膜上皮细胞后，静置24、48 h，弃去旧培养基，添加5 mg/ml的MTT 10 μl继续培养，每孔内加入二甲基亚砜200 μl，低速震荡5 min，待结晶物溶解后于酶标仪上以570 nm检测培养孔的吸光度。

2.5 炎性因子水平检测

采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)定量测定白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)，于LPS激活内膜上皮细胞24、48 h后取培养基悬浮液1 ml，4 ℃下2 500 r/min离心10 min，取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、IL-1β及TNF-α水平。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 子宫内膜上皮细胞增殖水平

24、48 h后，红景天苷低、中及高剂量组的子宫内膜上皮细胞增殖水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且红景天苷剂量越高，子宫内膜上皮细胞增殖水平越高，见表1。

表1 五组子宫内膜上皮细胞增殖水平比较Tab 1 Comparison of proliferation of endometrial epithelium

注：与空白对照组比较，①P<0.05；与红景天苷低剂量组比较，②P<0.05；与红景天苷中剂量组比较，③P<0.05；与正常对照组相比，④P<0.05

Note: vs. blank control group,①P<0.05; vs. low-dose group,②P<0.05; vs. medium-dose group,③P<0.05; vs. normal control group,④P<0.05

3.2 红景天苷对LPS诱导的子宫内膜上皮细胞分泌IL-6、IL-1β及TNF-α影响

24、48 h后，正常对照组，红景天苷低、中及高剂量组的IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且红景天苷剂量越高，IL-6、IL-1β及TNF-α水平越低，见表2。

表2 红景天苷对LPS诱导的子宫内膜上皮细胞分泌炎性因子水平影响Tab 2 Effects of salidroside on the secretion of inflammatory factors in LPS-induced endometrial epithelial

注：与空白对照组比较，①P<0.05；与红景天苷低剂量组比较，②P<0.05；与红景天苷中剂量组比较，③P<0.05；与正常对照组比较，④P<0.05

Note: vs. blank control group,①P<0.05; vs. low-dose group,②P<0.05; vs. medium-dose group,③P<0.05; vs. normal control group,④P<0.05

4 讨论

红景天的提取物包含红景天苷、苷元酪醇、络塞维、黄酮及其苷类化合物和萜及其苷类化合物，其中对红景天苷的研究最多，近年来红景天苷被广泛应用于抗衰老、抗肿瘤、心脑血管疾病及中枢神经系统保护的辅助治疗[5-8]。本研究通过LPS诱导子宫内膜上皮细胞建立模型。适当浓度的LPS可刺激细胞增殖，且LPS刺激细胞增殖活性与LPS刺激时间有关。刘瑜等[9]采用LPS刺激牙龈成纤细胞，采用MMT法观察牙龈成纤细胞增殖活性，结果显示，低质量浓度的LPS(0.1～1.0 μg/ml)可刺激牙龈成纤细胞增殖，LPS刺激细胞增殖可能与其影响细胞内外Ca2+的跨膜转运有关，亦可能直接激活细胞内其他信号，如细胞因子、NO等生物活性因子，再由上述生物活性因子间接刺激引发细胞增殖。但随着时间的延长，细胞对LPS刺激的耐受性下降，能量产生障碍，酶分泌增加，导致细胞溶解破坏，可表现为细胞毒性作用，细胞活性下降，细胞增殖水平逐渐下降。高质量浓度的LPS(>10.0 μg/ml)可经抑制细胞DNA合成或转录RNA等途径，抑制细胞增殖。本研究采用1.0 μg/ml的LPS应用于子宫内膜上皮细胞，正常对照组24、48 h的细胞活性显著高于空白对照组，与既往LPS刺激细胞增殖结果类似。本研究结果显示，24、48 h后，红景天苷低、中及高剂量组的子宫内膜上皮细胞增殖水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且红景天苷剂量越高，子宫内膜上皮细胞增殖水平越高。表明红景天苷具有细胞保护作用，且有浓度效应。但红景天苷细胞保护作用的确切机制尚未明确，可能与上调缺氧诱导因子-1α mRNA表达，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3活性等有关[10-11]。

TNF-α、IL-1β和IL-6是目前公认的参与LPS诱导炎症反应的重要介质。本研究采用LPS刺激子宫内膜上皮细胞造成细胞快速增增，并采用ELISA法检测LPS刺激子宫内膜上皮细胞24、48 h的炎性因子水平。结果显示，24、48 h后，正常对照组，红景天苷低、中及高剂量组的IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且红景天苷剂量越高，IL-6、IL-1β及TNF-α水平越低。表明LPS诱导后可引发子宫内膜上皮细胞的IL-6、IL-1β和TNF-α分泌增加，介导炎症反应；红景天苷可发挥抗炎作用，且剂量越高，抗炎效果越明显。现代药理研究结果证实，红景天苷的抗多种器官纤维化、抗炎作用的机制为调节转化生长因子β1的表达[3，12]。相关研究探讨了红景天苷对LPS诱导的脓毒血症大鼠心肌的保护作用及机制，结果发现，LPS可显著降低大鼠心脏细胞的肌酸激酶、乳酸脱氢酶、TNF-α、IL-α、IL-1β及丙二醛浓度，直接减轻重要器官组织的病变程度、炎性细胞浸润及组织细胞破坏程度[13]。张载潜等[14]采用高糖诱导肾小管上皮细胞，加入红景天苷，发现红景天苷能明显减弱高糖诱导的α-平滑肌肌动蛋白、胶原Ⅰ/Ⅲ型表达上调，恢复高糖诱导的E-钙黏蛋白表达下调，抑制胶原形成，进而减轻炎症反应。

综上所述，本研究采用LPS刺激子宫内膜上皮细胞，模拟子宫内膜炎症模型，从细胞水平观察红景天苷是否具有细胞保护及抗炎作用。结果表明，红景天苷可保护炎症反应下的子宫内膜上皮细胞，显著减轻炎症反应。但红景天苷如何改善炎症反应，有待于进一步研究。