苦参碱对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜微血管内皮细胞增生及血管内皮生长因子表达的影响Δ

张 铮

(承德医学院附属医院药学部，河北 承德 067000)

近年来，随着饮食习惯和生活方式的改变，糖尿病的发病率明显升高，且有逐步年轻化的趋势[1]。糖尿病视网膜病变是糖尿病的常见微血管并发症，主要是患者体内长期糖代谢紊乱，引起眼部微血管病变，严重时造成视力下降甚至失明，该病降低了患者的生活质量，并对患者生命安全构成重要威胁，已成为我国发病率最高致盲性眼病[2]。其典型病理表现可分为微循环障碍、视网膜-血管屏障被破坏和形成新生血管等[3]。如何选择安全有效的早期预防及治疗措施是研究的热点，研究结果表明，视网膜微血管的增生是视网膜病变的标志，其中血管内皮生长因子(VEGF)是最强力的促血管生成因子[4]。药理学研究结果证实，苦参碱具有很强的抑制细胞增生的作用，但目前尚未有关于苦参碱对微血管内皮细胞增生的影响研究[5]。本研究探讨了苦参碱对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜微血管内皮细胞增生及VEGF表达的影响，分析其作用机制，现报告如下。

1 材料

1.1 动物

雄性SD健康大鼠90只(SPF级)，年龄8周，体质量201～250 g，购自凯学生物科技(上海)有限公司，许可证号：NO.0251284。将所有大鼠分笼适应性饲养，自由饮食饮水，环境温度(22±1)℃，湿度(60±10)%，光照12 h/d，昼夜循环。

1.2 药品与试剂

苦参碱(批号：Dksj20171117)购于陕西昂盛生物试剂公司，剂量>99%；链脲佐菌素(规格：58 mg/kg，批号：S030-1)购于华中海威(北京)基因科技有限公司；戊巴比妥钠购于Biotopped公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购于美国Sigma公司；二乙烯四乙酸二钠(EDTA)和胰酶购于AMRESCO公司；超氧化物歧化酶1(SOD1)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和C反应蛋白(CRP)试剂盒购于上海沪震实业有限公司。

1.3 仪器

光学显微镜(洛阳惠尔纳米科技有限公司)；组织捣碎匀浆机(天津博天胜达科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 造模与分组

从适应性饲养后的90只大鼠中，按照随机数字表法抽取15只作为正常组，给予正常饮食饮水饲养。剩余的75只大鼠进行造模，先禁食10 h，然后给予链脲佐菌素50 mg/kg，腹腔注射；3 d后，抽取大鼠尾静脉血，测定血糖>16.7 mmol/L和尿糖3+～4+，即为造模成功，为糖尿病大鼠。继续饲养4周，将大鼠按随机数字表法分为模型组，对照组，低、中及高剂量组，每组15只。对照组大鼠给予羟苯磺酸钙30 mg/(kg·d)，稀释于5 ml蒸馏水中，灌胃；低、中及高剂量组大鼠分别给予苦参碱30、60及90 mg/(kg·d)，稀释于5 ml蒸馏水中，灌胃；正常组和模型组大神给予等量的蒸馏水。所有大鼠连续给药20周。

2.2 观察指标

2.2.1 大鼠血清相关指标的检测：抽取大鼠内眦静脉血2 ml，离心处理，取上清液即为血清，使用检测试剂盒，按照说明书操作，检测SOD1、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6及CRP含量。

2.2.2 病理切片的制作：将大鼠处死，摘取左眼眼球，置于冰面上，去除角膜、虹膜等，然后固定于固定液内48 h，取2 mm×2 mm的视网膜组织，做石蜡切片，常规苏木精-伊红(HE)染色，镜下观察视网膜细胞。

2.2.3 细胞凋亡情况：将各组大鼠右眼视网膜细胞做过碘酸雪夫(PAS)染色切片，采用光学显微镜观察(200倍)，自视乳头向前，每张切片随机选取4个视野，将总数除以50，计数每个视野内皮细胞凋亡数，取平均值。细胞凋亡判断标准为细胞核破碎、浓缩，细胞变小，早期细胞膜完整，晚期有凋亡小体。

2.2.4 VEGF、ANG1蛋白的表达检测：采用Western Bloting 法，用蛋白提取试剂盒提取视网膜组织标本，蛋白剂量由BCA法检测，检测VEGF、ANG1蛋白的含量。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 六组大鼠视网膜组织病理切片观察

病理切片显示，正常组大鼠视网膜细胞膜完整，结构清晰，毛细血管腔壁完整；模型组大鼠视网膜细胞水肿，组织结构紊乱，毛细血管腔内不规则扩张，内皮细胞增生，可见红细胞，周细胞水肿；对照组大鼠视网膜组织病变较模型组改善，但可见扩张的微血管；低、中及高剂量组大鼠视网膜细胞水肿症状好于对照组，并随着剂量的升高，细胞结构完整性提高，扩张的微血管更少，见图1。

A.正常组；B.模型组；C.对照组；D.低剂量组；E.中剂量组；F.高剂量组A. normal group; B. model group; C. control group; D. low-dose group; E. medium-dose group; F. high-dose group图1 各组大鼠视网膜组织病理切片Fig 1 Pathological sections of retinal tissue of each group

3.2 六组大鼠视网膜微血管内皮细胞凋亡情况比较

低、中及高剂量组大鼠视网膜微血管内皮细胞凋亡数明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着苦参碱剂量的升高，凋亡数增多，见表1。

表1 六组大鼠视网膜微血管内皮细胞凋亡情况比较Tab 1 Comparison of apoptosis of retinal microvascular endothelial cells among six groups

注：与模型组比较，*P<0.05，与对照组比较，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05

3.3 六组大鼠血清SOD1、MDA及CRP水平比较

低、中及高剂量组大鼠SOD1水平明显高于模型组和对照组，MDA、CRP水平明显低于模型组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着苦参碱剂量的升高，SOD1水平升高，MDA、CRP水平降低，见表2。

表2 六组大鼠血清SOD1、MDA及CRP水平比较Tab 2 Comparison of serum SOD1, MDA and CRP levels among six groups

注：与模型组比较，*P<0.05，与对照组比较，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05.

3.4 六组大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平比较

低、中及高剂量组大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显低于模型组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着苦参碱剂量的升高，TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低，见表3。

表3 六组大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平比较Tab 3 Comparison of serum TNF-α, IL-1β and IL-6 levels among six groups ng/L)

注：与模型组比较，*P<0.05，与对照组比较，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05

3.5 六组大鼠视网膜内VEGF、ANG1蛋白表达的比较

低、中及高剂量组大鼠视网膜内VEGF、ANG1蛋白含量明显低于模型组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着苦参碱剂量的升高，视网膜内VEGF、ANG1蛋白含量降低，见表4。

表4 六组大鼠视网膜内VEGF、ANG1蛋白表达比较Tab 4 Comparison of VEGF and ANG1 protein expression

注：与模型组比较，*P<0.05，与对照组比较，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05

4 讨论

糖尿病视网膜病变的主要表现是内皮细胞增生引起的微血管扩张[6]。其中VEGF和ANG是最强的促血管生成因子，可以特异性地作用于内皮细胞，刺激细胞的有丝分裂[7]，且能够增加血管通透性，促进毛细血管腔的形成。苦参碱是苦参的提取物，已有研究结果证实其具有抗心律失常、抗肝纤维化和免疫调节的作用[8]。本研究结果也证实，苦参碱各剂量组大鼠视网膜细胞损伤情况均好于对照组，并随着剂量的升高，细胞结构完整性提高，扩张的微血管更少，说明苦参碱能够明显改善视网膜损伤，减少微血管的生成。

在治疗糖尿病视网膜病变的过程中，抑制新生血管的形成是改善病情的关键[9]。本研究中，低、中及高剂量组大鼠视网膜微血管内皮细胞凋亡数明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着苦参碱剂量的升高，凋亡数增多。说明苦参碱能够明显抑制微血管内皮细胞的增生，效果优于羟苯磺酸钙。低、中及高剂量组大鼠血清SOD1水平明显高于模型组和对照组，MDA、CRP、TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显低于模型组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着苦参碱剂量的升高，SOD1水平升高，MDA、CRP、TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低。说明苦参碱具有抗炎和抗氧化作用，可以保护受损的视网膜细胞。目前，对糖尿病视网膜病变发生机制的研究主要集中于氧化及炎症反应和内皮细胞的增生2个方面[10-11]。高糖可以破坏内皮细胞的抗氧化防御系统，抑制SOD的表达，增加线粒体膜的通透性，从而损伤线粒体DNA，诱导细胞凋亡，其中MDA是氧化应激反应的产物[12]。视网膜细胞的损伤与炎症反应密切相关，TNF-α可诱导视网膜间充质细胞分泌细胞外基质蛋白，诱导血管活性物质表达，导致毛细血管闭塞[13]；IL-1β除能参与炎症反应外，还参与了多种与视网膜损伤发展相关的细胞因子合成和分泌，如长期得不到纠正，由IL-1β引起的炎症反应及微血管病变将导致视网膜病变发生；IL-6也具有上调CRP表达的作用，CRP水平升高会损伤血管内皮细胞[14]。 本研究中，低、中及高剂量组大鼠视网膜内VEGF、ANG1蛋白含量明显低于模型组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着苦参碱剂量的升高，视网膜内VEGF、ANG1蛋白含量降低。提示苦参碱可以抑制大鼠VEGF、ANG1的生成，与于静等[2]的研究结果一致，说明苦参碱改善大鼠视网膜病变是通过下调VEGF、ANG1的表达，抑制内皮细胞的增生来发挥的。VEGF不仅可以增加微血管内皮细胞的通透性，还可以调控相关炎性因子，与炎性因子互相影响，造成视网膜细胞的损伤，引起水肿，并促进微血管的形成[15]。但苦参碱是如何调控VEGF、ANG1的表达，其中何种信号通路在发挥作用，还需要进一步试验探讨。

综上所述，苦参碱可改善糖尿病大鼠的视网膜损伤，抑制视网膜微血管内皮细胞的增生；其是通过调节VEGF、ANG1的表达，提高SOD1的表达，减少MDA、CRP、TNF-α、IL-1β及IL-6含量来发挥改善病情的作用。