12周高强度间歇训练对不同基因型载脂蛋白E血脂异常人群的调脂作用*

贺莹莹， 王文荣

(1. 北京体育大学中国运动与健康研究院， 北京 100084， 2. 山东师范大学， 济南 250014)

血脂异常是指血浆中脂质成分升高或降低，产生异常后引发的一系列并发症，血中总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平过高，血中高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平过低是血脂异常的表现。流行病学的研究表明，血脂异常是心血管疾病的危险因素，血脂异常增加冠心病和缺血性脑卒中的发病风险[1]。

载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程。ApoE的基因多态性是导致个体间血脂水平存在差异的遗传因素。人类血浆有3种主要的异构体E2、E3和E4，ε2、ε3、ε4是3种常见的等位基因，能够编码形成6种基因型：ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4，通常将ε2/2、ε3/2作为ApoE2组，将ε3/4、ε4/4作为ApoE4组，将ε2/4、ε3/3作为ApoE3组。一项荟萃分析显示，与ε3/3基因型携带者相比，ε4基因型携带者患冠心病的风险增加了42%，而ε2基因型携带者没有显示出与冠心病的相关性[2]。

运动防治血脂异常如果实施得当既安全又无副作用，因此越来越受到相关领域专家学者的关注。有氧耐力性运动被公认为是防治血脂异常的有效手段，中低强度的有氧耐力性运动训练有助于引起血脂的有益性改变[3]，但高强度间歇训练(high intensity interval training, HIIT)作为有氧训练的形式之一，对血脂的改善作用还需要进一步研究。研究发现，运动强度是降低心血管疾病风险的独立相关因素，运动强度与心血管健康之间具有明显的剂量-效应关系[4]。

因此，本研究以血脂异常人群为研究对象，对其实施12周的HIIT干预，观察ApoE基因多态性对运动调节血脂异常的影响。

1 对象与方法

1.1 受试对象

在北京市海淀区的居民小区中通过发放问卷，调查45岁以上居民的健康状况和体力活动情况。实验共初筛受试者268人，对通过初筛的居民进行空腹血压、血脂、血糖、心率和心电图测试，根据2007年制定的《中国成人血脂异常防治指南》[5]，筛选空腹TC>5.2 mmol/L，TG>1.7 mmol/L；无心脏病和骨、关节疾病；无其他代谢性疾病；至少近6个月内无服用过降血脂药物和其他影响脂代谢的药物；无规律运动习惯；低体力活动水平；自愿参加本实验，并签订实验知情同意书的147人作为研究对象。在运动干预过程中，研究对象因病退出3人，因外出无法持续完成干预而退出12人，因运动干预后膝关节不适退出6人，因其他原因不愿继续参加实验退出38人，最后实际完成实验人数为88人，其中男性23人，女性65人。

1.2 血脂的测定

要求受试者在取血前一天不进行剧烈活动，晚餐清淡，无宵夜，空腹12 h后，于次日晨安静状态下采集静脉血2 ml，3 000 r/min离心15 min，取血清，采用全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)水平。

1.3 ApoE基因型测定

采用一次性口腔采样棉签采集受试者口腔粘膜，采用ARMS-PCR的方法进行测定。

DNA提取：采集口腔粘膜细胞进行DNA测定。用剪刀剪下蘸满口腔黏膜的拭子，加入700 μl SDS裂解液和5 μl蛋白酶K，剧烈涡旋震荡使样品充分分散。56℃水浴2 h以上，期间混匀几次；加入等体积的酚氯仿(1∶1)抽提，颠倒混匀，室温下，12 000 g，离心5 min; 转移上清至新的离心管中。加入等体积的氯仿抽提，室温下，12 000 g，离心5 min；加等体积的异丙醇，2 μl糖原，-20℃沉降2 h以上；4℃，12 000 g，离心10 min；加入75%乙醇(冷冻保存)漂洗，12 000 g，离心2 min；重复上述步骤一次；将柱子转移至新的1.5 ml离心管中，加入50～100 μl预热到65℃ ddH2O至柱子的膜中央。室温静置3 min，10 000 g离心2 min；DNA于-20℃保存，取2 μl用Nas-99测定DNA浓度。

引物设计见表1。

Tab.1The primer sequences for apolipoprotein E genotype identification

Primer nameSequence(5' to 3')Length/(bp)RS429358-WGGCGCGGACATGGAGGACGTGT22RS429358-MGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC26RS7412-WGATGCCGATGACCTGCAGAAGC22RS7412-MCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT26RS429358-RS7412-RCGGCCAGGGAGCCCACAGTGG21

PCR反应体系及循环参数：总体系17.2 μl，包括ddH2O 10 μl、2.5×buffer 4 μl、Taq酶0.2 μl、引物1 μl、模板2 μl。94℃预变性5 min， 94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s， 共35 个循环， 72℃延伸10 min，延伸循环完毕，取出PCR 管，置于4℃冰箱待测。

3730xl上机检测：96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μl，PCR产物1.0 μl；95℃变性3 min，上机检测; 将检测得到的原始数据文件导入到GeneMapper 3.2软件中进行分析。Rs7412/rs429358位点分型为TT/TT，说明受试者基因型为E2/2型；Rs7412/rs429358位点分型为TT/CT，说明受试者基因型为E2/3型；Rs7412/rs429358位点分型为CT/CT，说明受试者基因型为E2/4型；Rs7412/rs429358位点分型为TT/CC，说明受试者基因型为E3/3型；Rs7412/rs429358位点分型为CT/CC，说明受试者基因型为E3/4型。

1.4 运动方案

运动干预采用功率自行车运动，受试者在适应一周后开始正式干预实验。干预方案为受试者在功率自行车上完成60组起始负荷为0.5 kg，尽最大能力冲刺6 s，之后间歇9 s的短时间大强度间歇运动，其中间歇过程无负荷，空蹬功率自行车。受试者佩戴心率表，控制心率在80%～90%HRmax，最大心率以(220-年龄)作为参考，并通过询问受试着的自感疲劳程度(rate of perceive effort, RPE介于16～19)作为运动强度和运动安全性的监控指标。当受试者心率和RPE在当前负荷中有所降低时，需要增加 0.5 kg负荷，直至运动干预结束。干预过程中受试者通过提示音进行运动。干预共进行12周，每周3 d，每天1次。受试者在运动干预期间保持与干预前相同的饮食和体力活动习惯。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 ApoE基因型与等位基因频率分布特点

88例血脂异常者中检测出E2/2、E2/3、E2/4、E3/3和E3/4共5种基因型，未检测到E4/4基因型，等位基因分别为ε2、ε3和ε4。表2显示出，血脂异常患者中，ApoE基因型的分布比例为ApoE3/3>ApoE3/4 >ApoE2/3>ApoE2/2>ApoE2/4，等位基因ε3>ε2=ε4。

Tab.2ApoE genotypes and allele frequency distribution in dyslipidemia(n=88)

NGenotype frequency(%)Allele frequency(%)88E2/2E2/3E2/4E3/3E3/4ε2ε3ε44(5)6(7)2(2)68(77)8(9)8(9.1)72(81.8)8(9.1)

2.2 HIIT干预前不同ApoE基因型血脂异常者血脂水平的比较

将血脂异常者ApoE等位基因型分为3类，分别是ε2：E2/2+ E2/3、ε3：E3/3+ E2/4、ε4：E3/4，各等位基因型对应的血脂水平见表3。可以看出，HIIT干预前ε4等位基因组的TC水平显著高于ε2和ε3等位基因组(P<0.01)，ε4等位基因组的LDL-C显著高于ε2等位基因组(P<0.05)，其余指标在各组间无显著性差异(P>0.05)。

2.3 HIIT对不同ApoE基因型血脂异常者的血脂调节作用

如表3所示，12周HIIT干预显著降低ε3等位基因组的血清TC、TG、LDL-C水平(P<0.05)，显著升高HDL-C水平(P<0.05)。ε4等位基因组血清TC、LDL-C水平显著下降(P<0.05)，TG和HDL-C水平无显著变化(P>0.05)。总体样本和ε2等位基因组的血清脂质水平在运动干预后均出现有益性改变，但无显著性(P>0.05)。ε3等位基因组的空腹血糖和收缩压也出现显著性下降(P<0.05)。总体样本的BMI和腰臀比在干预后出现显著性下降(P<0.05)。

Tab. 3 Changes of indicators before and after 12 weeks HIIT among different ApoE n=88)

BW: Body weight； BMI: Body Mass Index； WHR: Waist-hip ratio； SBP: Systolic blood pressure； DBP: Diastolic blood pressure； HR： Heart rate； GLU: Fasting blood glucose； TC： Total cholesterol； TG： Triglyceride； LDL-C： Low density lipoprotein cholesterol； HDL-C： High-density lipoprotein cholesterol

*P<0.05,**P<0.01 beforevsafter intervention in each genotype group；#P<0.05,##P<0.01vsε2；△△P<0.01vsε3

3 讨论

ApoE基因全长3.7 kb，包含4个外显子和3个内含子，存在于第19号染色体长臂3区。ApoE2、ApoE3、ApoE4是ApoE的3种异构体，通过对人的3种ApoE异构体的氨基酸组成分析，发现第112位和第158位上氨基酸的不同是ApoE基因多态性的分析基础。ApoE3在第112位和第158位这两个位置上的氨基酸分别为半胱氨酸和精氨酸，而ApoE4在这两个位置上的氨基酸均为精氨酸，ApoE2在这两个位置上的氨基酸均为半胱氨酸。ApoE2、ApoE3和ApoE4这3种异构体是同一基因位点上的ε2、ε3、ε4三种等位基因的表达产物，ε2、ε3、ε4三种等位基因编码形成ApoE2/2、ApoE3/3、ApoE4/4三种纯合子和ApoE2/3、ApoE2/4和ApoE3/4三种杂合子表型。本研究对血脂异常人群ApoE基因型与等位基因频率的分析结果表明，血脂异常人群ApoE基因型以E3/3(为77%)占优势，检测到的5种基因型比例为ApoE3/3>ApoE3/4 >ApoE2/3 ApoE2/2>ApoE2/4，等位基因也以ε3(为81.8%)为主，其比例为ε3>ε2=ε4。黎旭等[6]对北京地区自然人群的研究发现，ApoE存在6种基因表型，其中ApoE3/3占比最大，约为65.6%，其次为ApoE2/3和ApoE3/4，ApoE2/2和ApoE4/4最少。等位基因在人群中的分布频率为ε2占9.1%，ε3占81.2%，ε4占9.7%，ApoE基因型及等位基因无明显的性别差异，对世界各地人群ApoE基因表型和基因频率的研究发现了相同的结果。以上结果说明，ApoE基因型和等位基因的频率分布在血脂异常人群和正常人群中相似。

时宝庆等[7]研究发现血脂水平受ApoE基因多态性影响，ApoE基因多态性是造成个体间血脂水平差异的独立遗传因素，并且ε4等位基因具有升高TC和LDL-C水平的作用。本研究显示ε4等位基因携带者的血清TC显著高于ε2和ε3等位基因携带者,ε4等位基因携带者的血清LDL-C水平显著高于ε2等位基因携带者，TG和HDL-C水平在各基因型之间没有显著性差异，提示ApoE基因型多态性与血脂异常的发生存在一定的关联，ε4等位基因携带者存在血脂异常的基因易感性。在健康人群中，ApoE各个基因型血浆TC水平由低到高依次为E2/2

规律的有氧运动对血脂有积极的调节作用[13]，但个体对运动的应答存在差异，考虑可能是特异的基因型调节运动对脂质的干预作用。2008年美国体力活动指南指出，较大运动强度仅需中等强度运动一半的时间，就能获得同样的健康益处[14]，而运动时间是影响运动参与性和持续性的重要因素，因此，本研究采用HIIT的运动干预方式。HIIT是指短时间高强度运动(70%VO2max-100% VO2max或70%～100% HRmax(220-年龄))[15-18]和短时间间歇期(低强度运动或安静休息)交替进行，不断重复多组的运动[19]，根据受试者的具体情况，可以选择不同的运动强度、恢复形式和运动时长。Abbie E[20]等人观察持续3周的两种大强度运动对肥胖女性血糖和血脂的干预效果，发现血脂和血糖指标均未发生显著性变化。Vatani D[21]等人的研究中让受试者进行6周的中等强度和高强度抗阻训练，发现载脂蛋白A、载脂蛋白B、TG未发生显著变化，与中等强度干预组相比，高强度干预组HDL-C水平显著升高。也有研究发现[22]，运动强度与HDL-C的浓度呈正相关，与TC、TG、LDL-C的浓度呈负相关。由此可见，运动强度是改善血脂等代谢状况的重要因素之一。

一项关于运动强度对餐后血脂影响与ApoE基因型关系的研究发现，中等强度和大强度运动对ε2、ε3等位基因携带者餐后血脂的降低都有效果，但是ε2等位基因携带人群在中等强度运动后降脂效果更明显，而ε3等位基因携带人群在高强度运动后降脂效果更明显[23]。ε4等位基因组运动干预后血脂的变化不尽相同，Lanny C[24]等通过28 d运动和饮食控制对肥胖青少年血脂异常的干预研究发现，ε4等位基因人群TC和LDL-C出现显著下降，TG和HDL-C未明显改善，而Paul D[25]等人观察不同基因型人群进行60%～85%VO2max递增强度运动6个月，TG出现明显下降，TC、LDL-C和HDL-C变化不明显。其他研究也表明，长期坚持运动锻炼才能引起TG的显著降低[26]。本研究中12周的HIIT干预后，发现ε3等位基因组的血清脂质水平改善最明显，ε4等位基因组干预后TC和LDL-C显著下降，而TG和HDL-C则无显著变化，ε2等位基因组的血清脂质无明显改变，提示对于HIIT的干预方式，ε3、ε4等位基因携带人群敏感，ε2等位基因携带人群不敏感。关于ApoE基因多态性对运动调脂效果的差别影响同样在耐力性有氧运动中得到证实。Hagberg等[27]对45～80岁参加耐力训练的男性的研究发现，血浆TC的下降和HDL-C的升高在ApoE2和ApoE3个体中显著大于ApoE4。Taimela等[11]对9～18岁规律参加闲暇体育活动的儿童青少年的研究发现，E2/3、E3/3和E3/4男子，体力活动水平与血浆TC和LDL-C改变呈负相关，与HDL-C呈正相关。Blanca[28]等发现在饮食控制结合耐力性训练、力量性训练或力量耐力综合训练后，血脂的有益性改变在ε2等位基因组中最为显著，ε4等位基因组变化最小。

本研究中12周的运动锻炼产生的效果属于近期锻炼产生的急性效应，不是长期运动锻炼产生的代谢变化，可能还不足以引起ε4等位基因携带人群TG的降低。运动对HDL-C的影响可能通过HDL在TG代谢中的作用来介导[29]。游离脂肪酸是长时间身体运动的主要能量来源，游离脂肪酸分别通过激素敏感和脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)的作用来源于肌内和循环TG。乳糜微粒和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)的脱脂产生过量的表面胆固醇，并转移至HDL颗粒上[30, 31]。富含TG的脂蛋白的血管内水解可以替代运动过程中使用的肌内脂肪，同时降低TG和增加HDL-C，这是运动训练升高HDL-C的假设机制之一。ApoE促进VLDL与LPL的相互作用[32]，大约40%的血浆ApoE与HDL组分有关[33]。ApoE4个体的ApoE水平较低[34]，可能是因为ApoE4和HDL颗粒的亲和力降低，使脂蛋白和ApoE更快地转移到LDL以及更快速的肝清除率[35]。降低的ApoE水平可以减少VLDL与LPL的相互作用，从而降低脂肪分解过程中胆固醇向高密度脂蛋白的输送，这将减轻HDL-C随运动训练的增加程度，这可能是本研究中ε4等位基因血脂异常者HDL-C变化不明显的原因。

综上，运动干预和基因型的特异性相互作用影响了血清脂质水平，虽然具体机制目前还不清楚，但直接支持了遗传变异性影响运动生理反应的概念。12周HIIT的运动干预方式能够有效改善ε3等位基因血脂异常人群血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平；对于携带冠心病遗传易患因子ε4等位基因的血脂异常者，HIIT的干预也能够显著降低其血清TC和LDL-C水平，这在其他耐力性运动干预方式中未发现，对于预防动脉粥样硬化等心血管疾病有积极意义；ε2等位基因携带者在12周HIIT干预后血清脂质水平未出现显著变化，提示ApoE等位基因对运动调节血脂异常的影响可能存在运动强度特异性，这为血脂异常者制定个性化运动处方提供参考依据。