EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期的表达及定位*

张伟伟， 邵淑丽△， 潘 阳， 李珊珊

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

骨骼肌卫星细胞的增殖分化对肌肉生长发育及损伤后的再生修复至关重要。骨骼肌卫星细胞增殖分化是一个复杂且协调的过程，该过程包括成肌细胞的增殖、细胞周期的退出、细胞融合及多核肌纤维的形成[1]。研究表明Myf5、MyoD、MyoG和MEF2等基因[2-5]在调控骨骼肌卫星生长发育中发挥重要作用，但仍然还有很多未知的调控机制，寻找和研究调控骨骼肌卫星增殖分化的重要功能基因是动物育种研究和肌性疾病治疗的重要目标之一。

EGR1基因广泛存在于哺乳动物和人类细胞中，属于即刻早期基因家族，在受到一系列外界刺激后能迅速且短暂激活，作为转录因子，通过与靶基因启动子上特异的位点结合，调控诸多靶基因的表达[6-8]，发挥各种生物学功能。但EGR1在骨骼肌卫星细胞增殖分化中的作用及入核机制仍不清楚。本文初步研究了EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中的表达、定位及入核机制，为探索EGR1调控牛骨骼肌卫星细胞分化的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛骨骼肌卫星细胞(muscle-derived satellite cells，MDSCs)由本实验室制备并鉴定[9]。高糖DMEM购自Gibco公司，胎牛血清和马血清购自BI公司，反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物有限公司，蛋白质提取试剂盒购自北京碧云天生物公司，无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA。

1.2 细胞培养及分化

在生长培养基(高糖DMEM+20%胎牛血清+10%马血清+5%青/链霉素) ，37℃，5%CO2的培养箱中培养牛MDSCs细胞，当细胞汇合度达到80%时，消化细胞以105个/孔接种于6孔细胞培养板中，加入生长培养基进行培养，当细胞汇合达85%后，更换为2%分化培养基(DMEM高糖培养液+2%马血清)，在分化时间分别为0 h (MDSC-P)、1 d (MDSC-D1)、3 d (MDSC-D3)和5 d (MDSC-D5)时观察细胞形态变化，每个时间点设置3个重复。同时收集细胞，用于后续的qRT-PCR和Western blot方法检测。

1.3 qRT-PCR检测EGR1基因转录水平表达

根据牛EGR1和β-actin基因的序列采用Prime 5 软件设计PCR引物。引物序列如下：EGR1-F:CAGGGGGAGGCAAGCGAGCAG，EGR1-R: ACTAGAACCTTCTCGTTATTC；β-actin-F:GACCTCTACGCCAACACG，β-actin-R:GCAGCTAACAGTCCGCCTA。将1.2中收集的各组细胞用Invitrogen Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并按照TransScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒说明书合成cDNA，然后，以其为模板，β-actin为内参，进行qRT-PCR。每组实验设置3次重复，每个重复点样时点3个孔，采用2-△△Ct方法计算基因的相对表达量。

1.4 Western blot检测EGR1蛋白表达

利用1.2中收集的各组细胞，按照蛋白质提取试剂盒(碧云天蛋白质提取试剂盒)的说明提取细胞总蛋白质。将提取到的蛋白质进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白质湿转到PVDF膜上，使用Odyssey封闭液室温封闭2 h，一抗EGR1 (ab191441, abcam)和 GAPDH (ab22555, abcam) 按照1∶500稀释，4℃孵育过夜，次日PBST洗膜；二抗室温孵育1 h，在Odyssey红外荧光扫描成像系统中进行扫描检测。

1.5 免疫荧光检测EGR1基因表达及其蛋白定位

MDSCs在生长培养基中培养汇合度达到80%时，消化后接种到6孔板，进行细胞爬片。当细胞汇合达85%后，更换为2%分化培养基，在分化时间分别为0 h (MDSC-P)、1 d (MDSC-D1)、3 d (MDSC-D3)和5 d (MDSC-D5)时用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗3次，每次5 min，加入PBST(透膜液) 室温静置30 min，PBS洗3次，每次5 min。1% BSA封闭1 h，加入封闭液稀释的一抗(1∶50)，37℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，加入封闭液稀释的二抗(1∶50)，37℃避光温箱孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min。DAPI避光温箱孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，加入DABCO(抗荧光淬灭剂)封片。分别使用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察并拍照。

1.6 EGR1蛋白的氨基酸序列进行磷酸化位点预测

查询NCBI Genbank中牛EGR1蛋白的氨基酸序列，利用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/和http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/ 网站对EGR1蛋白的氨基酸序列进行磷酸化位点预测。

1.7 EGR1基因载体构建及细胞转染

根据预测靶位点网站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)对EGR1基因启动子区(-354---+263)进行靶位点预测，确定2个CRISPRi干扰位点(表1)，每个干扰片段的5＇加上Bbs I酶切位点，序列合成后退火构建到pSPgRNA载体上，重组载体送上海生工生物工程有限公司测序鉴定，序列正确的载体命名为pSg-EGR1-1和pSg-EGR1-2。

Tab.1Two sgRNAs targeting different sites of EGR1 promoter

No.PositionSequenceE1-354--- -335CACCGGCCATGTACGTCACGACGGE2-104--- -88CACCGCGCCCCGCATGTGACC

根据NCBI公布的牛EGR1基因(Gene ID: 407125)mRNA序列，设计特异性引物(F:CCGGAATTCGCCACCATGGCGGCAGCCAAGGC，R:AAGGAAAAAAGCGGC CGCTTAGCA AATTTCAATTGTCCTGGGAG)。以牛MDSCs的cDNA为模板进行扩增，PCR产物经纯化回收克隆入pcDNA3.1(+)载体上。经测序鉴定后，以序列正确的重组载体为模板，进行位点突变载体构建，引物如下：mu-F:CGGAATTCGCCACCATGGCGGCAGC CAAGGC, mu-R: AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGCAAATTTCAATTGTCCTGGGGGC AAAGGTGGTTGT，测序鉴定后命名为S533A-p3.1-EGR1。

序列正确的载体转化后，摇菌，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，采用PEI法转染牛MDSCs细胞，转染48 h后，qRT-PCR和Western blot方法检测EGR1基因的表达，免疫荧光方法检测EGR1蛋白的定位。

1.8 统计学处理

以平均数±标准误表示，数据通过SPSS 16.0统计软件分化处理， 利用GraphPad Prism5软件进行作图。

2 结果

2.1 EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期表达

牛MDSCs分化1 d(MDSC-D1)、3 d(MDSC-D3)和5 d(MDSC-D5)的EGR1 基因的表达见图1A，由图可知，随着分化进行，和未分化的细胞(MDSC-P)相比，EGR1 基因的mRNA表达水平显著升高，分化第3日时表达量最高，随后呈下降趋势。EGR1基因的蛋白表达趋势和mRNA的趋势一致(图1B)。

Fig.1Expressions of EGR1 during the differentiation of MDSCs

A: Relative mRNA expressions of EGR1 gene detected by qRT-PCR; B: The protein expressions of EGR1 gene detected by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vsMDSC-P of EGR1

免疫荧光检测结果表明，EGR1蛋白主要在分化的MDSC中表达，并且随着肌管数量的增多而表达量增加(图2，见彩图页Ⅲ)。

2.2 EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期表达定位

EGR1蛋白在细胞中的分布见图3，未分化细胞中EGR1主要分布在胞质中(图3 MDSC-P)，随着细胞分化EGR1部分转移入细胞核(图3， MDSC-D1，MDSC-D5，白色箭头所指，见彩图页Ⅲ)。

2.3 EGR1蛋白入核机制初探

EGR1蛋白的氨基酸序列磷酸化位点预测结果见图4，由图可知，EGR1蛋白C末端第533位氨基酸是丝氨酸，是潜在的可被磷酸激酶磷酸化的位点(图4)，因此我们推测EGR1入核可能需要磷酸化。

Fig.4Sequence analysis of EGR1 amino acid

通过CRISPRi法干扰内源EGR1的表达，结果表明pSg-EGR1-2可有效干扰EGR1基因的表达，降低EGR1 mRNA和蛋白的表达水平(图 5)。

Fig.5Expression of EGR1 gene after transfected with pSg-EGR1

A: Relative mRNA expression of EGR1 gene detected by qRT-PCR; B: The protein expression of EGR1 gene detected by Western blot; CK： MDSCs transfected with pSPgRNA, pSg-EGR1-1: MDSCs transfected with pSg-EGR1-1, MDSCs transfected with pSg-EGR1-2.

*P<0.05,**P<0.01vsCK

将pSg-EGR1-2干扰载体和S533A-p3.1-EGR1过表达载体共转染MDSCs细胞后，共聚焦结果表明与对照组细胞相比，CRISPRi干扰组细胞核内未见EGR1表达(图6 pSg-EGR1-2转染组白色箭头所指)，之后转入突变过表达载体后，细胞质中EGR1表达增高(图6红色箭头所指)，但细胞核中仍未见EGR1表达(图6共转染组白色箭头所指，见彩图页Ⅳ)。

3 讨论

EGR1是一个Cys2-His2型锌指蛋白转录因子，大量细胞外信号刺激可激活EGR1表达，进而调节细胞生长、增殖、分化和凋亡[8]。骨骼肌发育是肉牛生长发育的重要组成部分，直接影响肉牛的产肉量和质量，研究者们也发现腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPKα2)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和腓肠肌自噬相关基因(atg)atg7、atg10、atg12、atg16L1 等基因在鼠骨骼肌发育及损伤后修复中表达变化显著[11,12]，但是目前尚未见EGR1在牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)发育中的报道。

为了明确EGR1基因在牛MDSCs分化中的作用，本研究检测了牛MDSCs分化不同时期EGR1 基因的表达变化。结果表明分化的MDSCs细胞中EGR1基因在mRNA和蛋白水平的表达都显著比未分化的细胞高，并且其表达量和分化的时间有关系，在分化的第3日达到最高量，随后开始下降(图1, 图2)。Abdulkadir等人的研究表明，干扰掉小鼠的EGR1基因后，其前列腺肿瘤细胞的发生过程受到损伤[12]，这就意味着EGR1基因在小鼠前列腺肿瘤细胞发育中的作用是抑制了增殖；Baron等人的研究也显示，EGR1基因是多种肿瘤细胞增殖的抑制因子[13]；Figliola R等人在小鼠C2C12细胞中随着成肌细胞分化EGR1表达增高[14]。这些结果也说明在我们的研究中EGR1基因的表达可能和MDSCs的分化存在着正相关，即促进MDSCs的分化。

作为核转录因子EGR1主要通过与靶基因启动子区域的GC框[15, 16]和Egr反应元件[17]相结合，上调或下调基因的转录，参与调节细胞的生长、分化、增殖和凋亡[18, 19]。在我们的研究中，在分化的MDSCs细胞核中观察到EGR1蛋白(图3)，说明EGR1蛋白进入到细胞核内发挥作用。已有文献报道EGR1入核由其C末端序列决定[20]。为了研究EGR1蛋白入核的机制，我们将EGR1蛋白C端第533位丝氨酸突变为丙氨酸，在干扰内源EGR1基因表达的基础上，在MDSCs细胞核中未检测到突变后的EGR1蛋白(图6)，表明533位丝氨酸发生磷酸化是EGR1入核所必需，这个结果和Ponti等人的研究结果是一致的[20]。

综上所述，EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化中表达显著升高，并且能够通过EGR1蛋白C末端533位丝氨酸磷酸化进入细胞核，暗示着EGR1可能通过调控某些基因的表达来调控细胞的分化。