参麦注射液对严重烫伤大鼠肠道屏障功能的保护作用*

杨 晨, 宋垚垚, 季一发

(1. 中国人民武装警察部队特色医学中心烧伤整形科， 天津 300162； 2. 解放军总医院第六医学中心烧伤科， 北京 100048； 3. 北京丰台右安门医院美容整形科， 北京 100069)

机体严重烫伤早期，毛细血管通透性增加使有效循环血流量相对不足，微循环障碍削弱了肠黏膜的屏障功能，由于菌群失调尤其是条件致病菌的大量扩增，肠道内细菌及其产物移至肠外，首先通过肠淋巴循环、门脉系统浸入周围的肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏等脏器，其次是细菌释放大量的内毒素入血后可以引起肠源性内毒素血症，此外肠内细菌及其产物的转移可以造成巨噬细胞的过度活化，释放大量的炎性介质，从而引发肠源性高代谢状态[1]。肠黏膜屏障功能的破坏是问题的关键[2]，因此，有效的维护和重建肠黏膜屏障具有重要的临床意义。研究证实，参麦注射液可有效防治严重烫伤，但对严重烫伤后肠黏膜屏障是否有修复作用未见报道，本实验通过建立严重烫伤大鼠模型，研究参麦注射液对肠黏膜屏障的保护作用，旨在为临床肠粘膜的早期保护提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

选用SPF级，健康 Wistar大鼠,体重 180～200 g，雄性，由北京维通利华实验动物中心提供，室温(25±1)℃，明暗交替各12 h，自由饮水取食。参麦注射液由雅安三九药业有限公司生产，国药准字：Z51021845。内毒素鲎试剂盒(上海市伊华临床医学科技公司)。双抗夹心放免测定试剂盒(邦定公司)。控时控温控压蒸汽烫伤仪(南昌大学医学院烧伤研究所)。

1.2 动物分组、给药

实验动物随机分为6组：正常对照组(Normal control group)；模型对照组(Model control group)，烫伤后立即灌胃生理盐水，每次10 ml/kg，每天1次；地塞米松治疗组(Hexadecadrol group)，烫伤后立即腹腔注射地塞米松10 ml/kg，每天1次；参麦注射液治疗组，低(Shenmai 5 mg/kg group)、中(Shenmai 10 mg/kg group)、高(Shenmai 15 mg/kg group)剂量组烫伤后立即腹腔注射5、10、15 mg/kg，每天1次。每组动物10只，烫伤后72 h麻醉取血、取材。

1.3 动物模型的制备

Wistar大鼠腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg进行麻醉，固定，背部8%硫化钠脱毛，脱毛区用控时控温控压蒸汽烫伤仪造成大鼠30%体表面积Ⅲ°烫伤，烫伤仪参数：压力3 MPa、温度107℃、时间8 s。各组烫伤后立即灌胃生理盐水3 ml抗休克，背部伤口用碘伏抗感染，每天1次，烫伤大鼠单笼饲养，对照组动物除不烫伤外，其余操作同烫伤组。

1.4 血浆DAO、TNF-α、IL-6含量测定

取无菌操作获得的血浆，溶解后，3 000 r/min离心10 min，取上清液，采用分光光度法，测定二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的含量；采用放射免疫法测定肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin, IL-6)的含量。

1.5 血浆内毒素的测定

各组动物于烫伤后72 h，无菌操作用一次性无菌注射器吸取下腔静脉血1.5 ml，肝素抗凝，1 000 r/min离心10 min，分离血浆，保存于-30℃冰箱。采用试剂盒，严格按说明书操作，采用鲎试剂偶氮基质显色进行定量。

1.6 肠粘液sIgA测定

无菌操作，剪取空肠回肠中段约10 cm肠管，用剪刀纵行剪开，轻轻去除肠内容物，用玻片轻轻刮取粘液，收集于1.5 ml离心管中，加入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)稀释，充分混匀后3 000 r/min离心15 min取上清液，采用试剂盒，严格按说明书操作，采用双抗夹心放免法测定，同时碧云天BCA试剂盒测定总蛋白，计算每毫克肠粘液中分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin, sIgA)含量。

1.7 大鼠肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结细菌移位量测定[3-4]

大鼠腹腔液培养：经颈总动脉放血处死大鼠，用75%乙醇消毒，在无菌超净台内用剪刀打开腹腔，取1 ml 0.15 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)反复冲洗腹腔，收集冲洗液，将其中0.1 ml冲洗液接种于LB琼脂培养基进行细菌培养，无菌分离肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结，称重，剪碎，匀浆。

内脏组织匀浆细菌培养：取腹腔冲洗液培养阴性的大鼠肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结匀浆液 0.1 ml接种于 LB琼脂培养基37℃培养48 h，统计菌落数，计算每克组织内细菌菌落形成单位数(colony forming units, CFU)。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠烫伤72 h血浆DAO、TNF-α、IL-6含量

与对照组相比，烫伤后72 h模型组大鼠血浆DAO、TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，各给药组大鼠血浆DAO、TNF-α、IL-6水平明显降低(P<0.01，表1)。

2.2 各组大鼠烫伤72 h血浆内毒素含量

与对照组相比，烫伤后72 h模型组大鼠血浆内毒素水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，各给药组大鼠血浆内毒素水平明显降低(P<0.01，表2)。

2.3 各组大鼠烫伤72 h肠粘液sIgA含量

与对照组相比，烫伤后72 h模型组大鼠肠粘液sIgA水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，各给药组大鼠肠粘液sIgA水平明显降低(P<0.01，表2)。

GroupDAO(U/ml)TNF-α(ng/ml)IL-6(ng/L)Normal control0.06±0.020.20±0.0680.3±11.8Model control0.94±0.17**3.52±1.15**337.3±29.5**Hexadecadrol0.73±0.15##2.35±0.39##272.6±42.5##Shen-mai 5 mg/kg0.79±0.12#2.48±0.60#291.4±44.1#Shen-mai 10 mg/kg0.70±0.17##△2.40±0.53#304.8±38.9#Shen-mai 15 mg/kg0.64±0.13##2.32±0.41##259.4±46.3##▲

DAO: Diamine oxidase; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-6: Interleukins-6

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.01,

##P<0.01vsmodel control group;△P<0.05vsShenmai 5 mg/kg group;▲P<0.05vsShenmai 10 mg/kg group

GroupEndotoxin(Eu/L)sIgA(μg/g)Normal control1191.3±236.884.9±14.1Model control7156.1±1806.7**60.8±9.6**Hexadecadrol3312.2±1105.8##75.5±11.8##Shen-mai 5 mg/kg4005.5±988.8##72.1±11.7#Shen-mai 10 mg/kg3250.1±1459.0##76.1±8.7##Shen-mai 15 mg/kg2746.3±1076.7##△75.4±10.0##

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.01,

##P<0.01vsmodel control group;△P<0.05vsShenmai 5 mg/kg group

2.4 各组大鼠烫伤后肝、脾、肠系膜淋巴结细菌移位量

除对照组外，模型组和各给药组肝、脾、肠系膜淋巴结组织细菌培养均有菌落形成。各给药组肝、脾、肠系膜淋巴结组织细菌移位量明显低于烫伤组(P<0.01，表3)。

Group Liver SpleenMesenteric lymph nodesNormal control 0±0 0±0 0±0Model control189.8±33.2**360.8±161.1**933.2±241.8**Hexadecadrol87.9±26.2##130.5±30.3#514.3±164.8#Shen-mai 5 mg/kg147.2±22.2##ΔΔ238.9±87.3##ΔΔ669.0±221.4##Shen-mai 10 mg/kg139.5±26.3##ΔΔ156.4±54.7##▲576.2±212.7##Shen-mai 15 mg/kg107.9±21.6##▲▲○○133.2±41.9##▲▲500.4±230.9##

CFU: Colony-forming units

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.01,

##P<0.01vsmodel control group;ΔΔP<0.01vshexadecadrol group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsShenmai 5 mg/kg group;○○P<0.01vsShenmai 10 mg/kg group

3 讨论

胃肠道血流丰富，最易受到缺血缺氧的损害。正常情况下，胃肠屏障保护胃肠道免受肠腔内细菌及其内毒素的侵害。严重烫伤后，由于创伤应激状态，往往破坏肠上皮细胞之间的紧密连接，导致肠粘膜屏障功能削弱，肠粘膜通透性立即增高，从而使肠道细菌和蓄积的内毒素得以侵入体内形成菌血症和内毒素血症，重者导致全身播散，循环中的内毒素又可反馈性地促进肠道中细菌和内毒素持续入血，形成一恶性循环[5-6]。如何防治严重烫伤后细菌易位和内毒素入血是广大临床医生极为关注的问题。

肠道菌群之间相互协同、拮抗，并与肠黏膜粘附结合形成生物屏障，阻碍致病菌对机体的侵袭。烫伤后，生物屏障功能减弱，大肠埃希菌等机会致病菌过度生长并穿过生物屏障侵入血液、淋巴[7]。本研究中给予参麦注射液治疗组能够显著降低组织细菌移位量和血液细菌内毒素水平。

二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)是一种具有高度活性的细胞内酶，存在于哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中。DAO在外周血中活性稳定，能够反映肠上皮细胞的完整性以及肠黏膜屏障的功能状态。降低脓毒症大鼠肠组织血液TNF-α、IL-6等含量，可显著减轻脓毒症大鼠肠黏膜损伤[8]。本实验中，烫伤72 h后，大鼠发生肠黏膜屏障受损、炎症反应增强，参麦注射液治疗，可降低机体的炎症反应，改善烫伤后肠黏膜屏障功能，增加机体抗打击和促进恢复的功能。

肠粘膜表面粘液层具有重要的生理屏障作用，粘液中的糖蛋白和sIgA相互配合，将sIgA包被的细菌牢固限于粘液层中，并随粘液层的更新和流动将包被的有害菌排除体外。烫伤的机体免疫功能受损，sIgA分泌减少，外袭菌易于粘附定植，诱发细菌移位(bacterial translocation, BT)的发生，甚至造成全身播散性感染[9]。实验结果表明，大鼠烫伤后72 h即有肠粘液局部体液免疫功能降低，参麦注射液可改善肠道免疫功能，其机制可能与刺激浆细胞分泌sIgA水平，从而降低肠道细菌移位量，减少肠源性感染的发生。