右美托咪定对大鼠海马神经元生长发育的影响及其机制*

刘煜鑫, 闫 东

(1. 重庆永川区儿童医院麻醉科, 重庆 402160; 2. 重庆医科大学附属永川医院麻醉科， 重庆 402160)

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一种α2肾上腺素受体激动剂，α2-肾上腺素受体的亲和力是可乐定的8倍[1-3]。右美托咪定广泛用于临床麻醉的辅助药物。随着全身麻醉在临床中的应用，近年来越来越多的研究关注全身麻醉药物的中心毒性作用，特别是在神经元的发育上，这对婴儿具有重要意义。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作为神经因子家族的重要成员，通过促进神经细胞的增殖和分化来调节和维持神经系统的发育和功能。突触是神经元之间传递信息的重要途径，其结构由突触前膜，突触间隙和突触后膜组成。神经元以突触的形式形成复杂的神经网络，并在中枢神经系统的生理和病理过程中起重要作用。BDNF与酪氨酸受体激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)特异性结合后，构象发生改变，导致下游关键激酶磷酸化，促进BDNF在神经元和树突中的表达，激活BDNF-TrkB信号通路，BDNF在突触前调控中发挥重要作用[4-6]。本研究通过分离和培养新生大鼠海马神经元，探讨了DEX对新生大鼠海马神经元发育相关基因表达及BDNF-TrkB信号通路相关分子表达的影响，为研究DEX对神经元的发育影响提供数据支持。突触素(synaptophysin，SYN)分布于突触前膜，突触后致密物95蛋白(PSD95)位于突触后结构中，这些突触特异性蛋白标志物可以直接或间接反映突触活动，形态学改变和突触的生物学功能[7-8]。本研究分析了新生大鼠海马神经元的活性和凋亡情况，进一步研究DEX通过BDNF-TrkB信号通路发挥的生物学作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

主要试剂：DMEM培养基(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，CCK8试剂盒(南京凯基生物有限公司)，右美托咪定(江苏恒瑞医药股份有限公司)，TUNEL试剂盒(南京诺唯赞生物有限公司)，RNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)，逆转录试剂盒(Thermo Fisher)，Neurobasal培养基、B27添加剂(Gibco)，谷氨酰胺、辣根过氧化物酶标记的二抗和单克隆抗体TrkB、NMDAR、p-NMDAR、GAPDH、BDNF均购于Abcam公司。

主要仪器：光学显微镜(OLYMPUS BX53)，CO2培养箱(Thermo Scientific系列8000)，核酸定量仪器(Nanodrop 2000)和荧光定量PCR检测系统(Applied Bio systems 7500)

1.2 海马神经元细胞分离与培养

新生大鼠分娩后24 h内通过颈椎脱臼处死，然后将新生大鼠置于75%乙醇中2 min，去除老鼠头部的皮肤和头骨，取出整个大脑。在解剖显微镜下，仔细地去除嗅球，隔膜，丘脑和下丘脑，然后剥离硬膜和脉络丛，并将大脑皮层下的海马组织取出到预冷的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。用眼科剪将海马组织切成小块，然后加入0.25%胰蛋白酶/ 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)并在37℃下消化5 min，以制备单细胞悬液。离心除去上清后，将细胞沉淀悬浮于DMEM完全培养基(含2%B27，1%谷氨酰胺，10%胎牛血清)中，接种于细胞培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱，贴壁6～8 h后，将细胞转移至Neurobasal培养基(现用现配，含有2%B27，1%谷氨酰胺和100 IU/ ml青霉素)。

1.3 实验设计

实验分为4组：对照组、1 μmol/L DEX处理组、5 μmol/L DEX处理组和50 μmol/L DEX处理组，各组加入不同剂量DEX(1 μmol/L 、5 μmol/L 、50 μmol/L)，分别于处理 2、4、6、8和10 d后检测海马神经元细胞活性，于处理10 d后检测细胞的凋亡、SYN和PSD95的 mRNA表达以及BDNF-TrkB信号通路中信号分子表达情况。

1.4 CCK8检测细胞活性

将大鼠海马神经元细胞用胰蛋白酶消化成单细胞，接种于96孔细胞培养板，接种密度104个/孔，每组设置6个复孔(对照组、1 μmol/L DEX处理组、5 μmol/L DEX处理组、50 μmol/L DEX处理组)，置于CO2培养箱培养，待贴壁后，各组加入不同剂量DEX(1 μmol/L 、5 μmol/L 、50 μmol/L)处理，于DEX处理 2、4、6、8和10 d后，分别加入CCK8溶液混合，避光孵育30 min，用酶标仪检测450 nm波长吸光度。

1.5 q-PCR

DEX处理10 d后，根据RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，提取后通过Nanodrop 2000检测RNA浓度和纯度。根据逆转录试剂盒说明书中，将总RNA逆转录为cDNA。通过RT-PCR检测相关基因表达。引物序列如下：SYN(NM_008596)正向：CGCACCTCGGACAAGTCTC，反向：CCCGAAGG CGAAAATAGCAAA; Dlg4(PSD95，NM_001109752)正向：TCCGGGAGGTGACCCATTC; 反向：TTT CCGGCGCATGACGTAG。 PCR反应参数如下：94℃预变性10 min，95℃变性10 s，退火温度根据引物的解链温度，反应时间20 s，72℃延伸30 s 40个循环。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡

取对数生长期的大鼠海马神经元细胞，消化接种于6孔培养板内进行细胞爬片，细胞生长良好后，分别给予1 μmol/L、5 μmol/L、50 μmol/L DEX和空白对照处理10 d。按TUNEL检测试剂盒说明书进行操作，在光学显微镜下观察细胞形态，胞核呈棕褐色者为凋亡细胞，每张片至少观察 500个细胞，计数每100个细胞中的凋亡细胞数，再取其平均值，得出凋亡指数。

1.7 免疫印迹

蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶浸入转移缓冲液中10 min并转移至膜上45～60 min，然后用Tris缓冲液(TBS)漂洗PVDF膜10～15 min，并加入适当稀释的抗体(含1%Tween-20的TBS稀释的脱脂奶粉)，并且在室温下孵育2 h。然后将PVDF膜用TBST冲洗3次(每次5～10 min)，并与HRP标记的二抗孵育，二抗用含有0.05%脱脂奶粉的TBST稀释(1∶10 000)。孵育结束，用TBST漂洗膜3次，每次5～10 min。实验结果通过荧光化学发光成像仪曝光处理，用分析软件分析目的蛋白与内参蛋白的吸光度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 DEX对海马神经元细胞活性的影响

实验结果显示，不同浓度的DEX处理组和对照组神经元细胞的活性和凋亡曲线在2～10 d无显著性差异(P>0.05, 图1)。制备载玻片上生长的神经元细胞并通过荧光检测和Image Pro Plus 6.0软件计数，结果显示对照组与处理组之间的阳性细胞数量无显著差异(P>0.05, 表1)，该结果表明DEX对神经元细胞无神经毒性。

Fig.1Cell activity was detected by CCK8 assays

GroupCell activitySYN mRNA expressionPSD95 mRNA expressionControl72.2±7.41.001.001 μmol/L DEX75.4±6.71.39±0.041.13±0.035 μmol/L DEX75.8±5.81.41±0.031.16±0.0250 μmol/L DEX78.3±8.34.18±0.56**##3.15±0.09**##

DEX: Dexmedetomidine; SYN: Synaptophysin; PSD95: Postsynaptic density protein 95

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe 1 μmol/L DEX group

2.2 DEX对SYN和PSD95的 mRNA表达的影响

通过q-PCR检测SYN和PSD95的mRNA表达，DEX对海马神经元发育的影响。与对照组相比，1和5 μmol/L DEX处理组的SYN和PSD95 mRNA表达无显著差异(P>0.05)，用50 μmol/L DEX处理组中，观察到SYN和PSD95 mRNA表达具有显著性差异(P<0.01, 表1)，该结果显示DEX对大鼠海马神经元发育具有重要作用。

2.3 DEX对BDNF-TrkB信号通路中信号分子表达的影响

免疫印迹分析用于检测DEX对BDNF、TrkB、N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDA)蛋白的表达和磷酸化水平的影响(图2)。与对照组相比，50 μmol/L DEX处理组BDNF表达水平显著增加，对照组与处理组之间TrkB蛋白表达无明显差异。p-NMDAR的表达随着DEX浓度的增加而增加，与对照组相比，只有高剂量组差异显著(表2)，DEX的神经保护作用通过上调BDNF的表达和N-甲基-D-天冬氨酸受体的磷酸化水平来实现。

Fig.2The expressions of BDNF and TrkB in the four groups by the Western blot

GroupBDNF TrkBNMDAR p-NMDARControl0.77±0.030.52±0.020.31±0.010.17±0.021 μmol/L DEX0.79±0.010.58±0.020.34±0.020.25±0.025 μmol/L DEX0.89±0.030.59±0.030.39±0.030.33±0.0350 μmol/L DEX1.55±0.03**##0.61±0.020.37±0.010.72±0.05**##

BDNF: Brain-derived neurotropic factor; TrkB: Tyrosine receptor kinase B; NMDAR: N-methyl-D-aspartate receptor

*P<0.05,**P<0.01vsthe control group;#P<0.05,##P<0.01vsthe 1 μmol/L DEX group

3 讨论

美托咪定是α2肾上腺素受体的激动剂，它是左旋美托咪定和右旋的混合物，左旋的美托咪定无药理学作用[9]。右美托咪啶在临床上用作镇静和止痛药，其对α2肾上腺素受体的敏感性高于美托咪定[10-11]。右美托咪定具有多种保护作用，包括心肌保护、肺组织保护及神经病保护作用等。武勇等的研究显示右美托咪定可以减轻高血压心肌肥厚患者围术期心肌损伤，对心肌具有一定的保护作用[12]。何金波等[13]研究发现右美托咪定通过抑制TLR4表达从而对肺起到保护作用。为了减少全身麻醉在神经系统上的有害影响，氯胺酮和丙泊酚等麻醉药物可与右美托咪定联合用于麻醉，这种方法已成为临床上的趋势。尚宇等[14]研究显示右美托咪定预处理可以减少脑缺血/再灌注时兴奋性氨基酸释放，从而产生对脑的保护作用。

本研究通过新生大鼠海马神经元的分离培养，探讨了DEX对新生大鼠海马神经元发育及其参与BDNF-TrkB信号通路的分子表达的影响，提供更加详细的数据支持DEX的临床应用。海马是脑组织的重要组成部分，其结构和边界相对清晰，容易解剖和分离，这些优点使其成为神经药理学实验的理想组织。突触特异性蛋白质标记物如SYN和PSD95直接或间接反映了突触活动，形态变化和突触生物学功能,通过测定SYN和PSD95 mRNA的表达水平来间接显示神经元发育状态。本研究应用不同浓度的DEX处理后，分析新生大鼠海马神经元细胞活力和凋亡情况。采用q-PCR检测SYN和PSD95基因的表达差异，以探讨海马神经元的发育情况。CCK8和TUNEL实验结果显示，不同剂量的DEX处理后，2～10 d的神经元活性和凋亡曲线与对照组相比无统计学差异，DEX处理组(1,5和50 μmol/L)与对照组之间的细胞数无显著性差异，这表明DEX本身对神经细胞没有毒性，这与之前研究一致，DEX通过减少Cx32蛋白水平抑制间隙连接活性来减少缺氧/复氧诱导的细胞凋亡[15]。DEX的神经保护作用减弱了异氟醚通过抗氧化，抗炎和抗细胞凋亡的特性在衰老的大鼠中诱导认知功能障碍[16]。然而，虽然DEX在临床剂量下具有神经保护作用，但高累积剂量和浓度下可诱导体内和体外神经细胞凋亡[17]。

BDNF和TrkB的结合导致构象变化，并进一步促进下游关键激酶的磷酸化。研究已经证明BDNF-TrkB信号通路能够激活MEK/ERK，PI3K/Akt和PLC-γ1信号通路等重要通路[18-19]。本研究分析了DEX对BDNF-TrkB信号通路及其与NMDA受体表达相关的下游效应分子及其磷酸化水平的影响。结果表明50 μmol/L DEX处理后，BDNF蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。然而在用不同浓度的DEX处理后，各组之间TrkB表达水平无显著差异，TrkB蛋白表达水平与DEX无相关性。不同浓度DEX处理后，p-NMDAR水平呈上升趋势，但NMDAR蛋白表达水平无统计学差异。以上结果证明DEX在达到一定剂量(50 μmol/L)可对海马神经元有一定的保护作用，其可能通过上调BDNF-TrkB信号通路中BDNF的表达和N-甲基-D-天冬氨酸受体的磷酸化水平来实现。