中药对鲍曼不动杆菌的体外抑菌试验

李永慧,王洪彬,朱利霞,吴同垒,孔庆山,张志强

(1.秦皇岛第二医院,河北 昌黎 066600；2.河北科技师范学院动物科技学院河北省预防兽医学重点实验室,河北 秦皇岛 066004)

随着中国经济的快速发展、人民消费水平的提高,水产鱼类消费品的需求量大幅度提高,水产养殖业朝着集约化、规模化的方向发展。近年来,水产养殖中细菌病频发,且病死率极高,给水产养殖造成了重大的经济损失,极大限制了海水养殖业的发展[1]。相关研究表明,鲍曼不动杆菌在鳜鱼养殖中暴发病害,死亡率高达90%,给广大养殖户带来巨大经济损失等[2]；同时该菌也是人类的条件性致病菌,主要引起呼吸道感染、手术部位感染以及泌尿系统感染等[3],引起了广大科研人员和养殖工作者的关注。

在中国,中药用于水产动物养殖相比抗生素和化学疗法防控细菌病来说,具有低毒、无抗药性以及提高鱼类水产养殖动物摄食率和抗病能力等优点[4],深受养殖工作者的信赖。试验通过选取苏木、黄连等多味中药水煎液对鲍曼不动杆菌进行了体外抑菌试验,进一步筛选出对该病原菌具有明显抑菌作用的中药,为进一步水产用药提供重要的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 试验菌株从患病死亡的舌鳎鱼肝脏分离得到,经实验室工作人员前期鉴定,最终确定为鲍曼不动杆菌,并保存于河北科技师范学院、河北省预防兽医学重点实验室-80℃低温冰箱中。

1.1.2 中药和试剂 中药：女贞子、苏木、板蓝根、连翘、黄芩、夏枯草、苦参、马齿苋、桔梗、防风、郁金香、蒲公英、厚朴、香附、青皮、荆芥、乌梅、紫花地丁、石榴皮、诃子、艾叶、知母、龙胆草、栀子。试剂：营养肉汤培养基,购自青岛高科园海博生物技术有限公司；普通的营养琼脂,购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.3 主要仪器 G1040WS-立式自动压力蒸汽灭菌器,致微(厦门)仪器有限公司；无菌工作台,北京亚泰科隆仪器技术有限公司；冰箱,青岛海尔特种电冰箱有限公司；隔水式恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司,其他与试验相关的仪器均由河北科技师范学院、河北省预防兽医学重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 试验菌液制备 用无菌接种环挑取甘油冻存的鲍曼不动杆菌临床分离株,接种到4 mL营养琼脂培养基中,置于28℃隔水式恒温培养箱中培养12～16 h。从营养琼脂平板上挑取单菌落,接种于含有3 mL的营养肉汤培养基中培养16～24 h。用灭菌水稀释培养液,使菌液浓度达到1×107CFU/mL,备用。

1.2.2 单味中药药液制备 采用水煎煮法制备试验所需要的中药药液。将中药药材用水洗干净,烘干；用电子天平准确称取中药药材100 g,置于1 000 mL的烧杯中,加入500 mL蒸馏水,浸泡2 h；武火加热至沸腾,改用文火加热40 min,4层纱布过滤,药渣加入适量的蒸馏水,采用同样的方法煎熬,过滤,弃去药渣,合并两次过滤所得的药液,过滤,加热浓缩至终体积100 mL,即中药药液终浓度为1 g/mL[5]。

1.2.3 中药体外抑菌圈直径的测定 利用牛津杯法测定中药对鲍曼不动杆菌的抑菌圈大小。在营养琼脂平板上加入100 μL的试验菌液(菌液浓度为1×107CFU/mL)菌液,用无菌涂布器将菌液涂布均匀；在培养基表面等距离的摆放4个牛津杯并轻轻按压,使其培养基接触；在杯中加入不同的单味中药药液各200 μL,每种药物做3个重复；置于28℃隔水式恒温培养箱中培养16～24 h,观察结果[6]。

结果判定：以牛津杯周围无肉眼可见细菌生长区为抑菌圈,用直尺测量抑菌圈直径大小,取3次测量结果的平均值作为药物对鲍曼不动杆菌的抑菌圈大小。抑菌圈直径以d表示,当d＜10 mm时,为耐药(R)；当10≤d≤15时,为中度敏感(I)；当d＞15 mm时,为高度敏感(S)。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用肉汤二倍稀释法测定中药对鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度。将单味中药药液(药液浓度为1 g/mL)依次用营养肉汤进行二倍稀释总共稀释11个梯度；依次加入到96孔细菌版的11个孔中,每孔加入200 μL,然后每孔加入20 μL菌液(菌液浓度为1×107CFU/mL)；第12孔中加入200 μL的营养肉汤,加入20 μL菌液(菌液浓度1×107CFU/mL)做空白对照；置于28℃隔水式恒温培养箱中培养16～20 h,观察结果[7-8]。为方便观察试验结果,可在96孔细菌培养板中加入浓度为5 g/L的TTC(氯化三苯四氮唑,加入该物质目的是准确判断MIC值)5 μL,并28℃置于隔水式恒温培养箱中培养2 h。判定标准：当孔内不显示红色时,为该中药对鲍曼不动杆菌的MIC。

1.2.5 MBC值的测定 在加入TTC显示颜色变红的各个孔中,分别吸取50 μL接种于营养琼脂平板上,培养12～16 h,观察结果。平板上无细菌生长时所对应孔最小的药物浓度即为该中药对鲍曼不动杆菌的MBC。

2 结果

2.1 中药对鲍曼不动杆菌的药敏试验结果 采用牛津杯法检测鲍曼不动杆菌对常用中药的药物敏感性,结果见表1。鲍曼不动杆菌对苏木、连翘、夏枯草、乌梅、紫花地丁这5种中药高度敏感；尤其是苏木对该菌的抑制效果最好,抑菌圈高达28 mm；对黄芩和青皮中度敏感；对诃子、女贞子、板蓝根、苦参、马齿苋、桔梗、防风、郁金香、蒲公英、厚朴、香附、荆芥、石榴皮、艾叶、知母、龙胆草、栀子耐药。说明中药对鲍曼不动杆菌具有一定程度的敏感性。

表1 中草药对鲍曼不动杆菌的体外抑菌试验

2.2 中药对鲍曼不动杆菌的MIC和MBC 采用营养肉汤二倍稀释法检测中药对鲍曼不动杆菌的MIC和MBC,结果见表2。苏木对鲍曼不动杆菌的MIC=MBC=31.3 mg/mL,相比其他中药的MIC和MCB小；其次为夏枯草,MIC=MBC=62.5 mg/mL,连翘和黄芩对该菌的MIC相同,均为125.0 mg/mL,但前者MBC为125 mg/mL,后者MBC为250 mg/mL；青皮和紫花地丁对该菌的MIC和MBC均为250 mg/mL；乌梅对该菌的MIC=250 mg/mL,MBC=500 mg/mL。说明每种药物对杆菌的敏感度不同,水产养殖可以此为参考合理安排用药量,用于鲍曼不动杆菌病的防控。

表2 中药对鲍曼不动杆菌的MIC和MBC (mg/mL)

3 讨论

近年来,随着水产养殖规模的扩大和养殖数量的增多,细菌性疾病,如弧菌病、爱德华菌病、假单胞菌病以及鲍曼不动杆菌病等频发,给水产养殖健康、长远发展带来了极大的挑战,因此对水产养殖致病菌的准确检测和防控尤为重要[9]。尤其是鲍曼不动杆菌是一种人兽鱼共患菌,引起了广大科研工作者和养殖工作者的极大关注。鲍曼不动杆菌是不动杆菌属成员之一,革兰染色阴性菌,不发酵糖,有荚膜、菌毛且无鞭毛和芽孢[10]。相关的文献显示,鲍曼不动杆菌极易产生耐药性,常常导致水产养殖用药的失败,且能用于有效防控该致病菌的药物又少[11]；此外对常用抗生素的耐药率有逐年增加的趋势,这引起了相关研究人员的极大关注[3]。

中药具有来源广泛、价格低廉、毒性较低、不易产生耐药性等优点,在防病抗病毒的同时还能增强机体的免疫力,提高动物机体整体的抗病抗菌能力[6]。因此中药作为抗生素的替代药物在解决药物残留和抗药性方面具有良好的发展前景。从试验结果可以看出,苏木、连翘、夏枯草、乌梅、紫花地丁这5种中药对鲍曼不动杆菌高度敏感；苏木对该菌的MIC和MBC相等,均为31.3 mg/mL；夏枯草对该菌的MIC和MCB均为62.5 mg/mL；连翘和黄芩对该菌的MIC均为125.0 mg/mL,但前者MBC为125 mg/mL,后者MBC为250 mg/mL；青皮和紫花地丁对该菌的MIC和MBC均为250 mg/mL；乌梅对该菌的 MIC=250 mg/mL,MBC=500 mg/mL,其他中药对该菌表现耐药,说明部分中草药对鲍曼不动杆菌具有一定程度的抑制作用。