四川省阿坝州牦牛和藏绵羊梨形虫分子流行病学调查

钟 维,杜雪梅,郝力力,袁东波,郭 莉,侯 巍,鲁志平,莫 茜,阳爱国,毛清方,罗小丽,土登卓玛

(1.西南民族大学生命科学与技术学院,四川 成都 610041；2.四川省动物疫病预防控制中心,四川 成都 610041；3.四川省石渠县畜牧局,四川 石渠 627350)

梨形虫病(泰勒虫病和巴贝斯虫病)是寄生于脊椎动物红细胞或者其他细胞内的蜱传性寄生虫病,可导致牛羊产生发热、贫血、消瘦、黄疸和血红蛋白尿等症状,严重时可导致死亡,常给牛羊养殖业造成巨大经济损失,严重制约牛羊养殖业的发展。牦牛和藏绵羊是四川省阿坝州主要的经济动物,也是当地居民主要的经济收入来源之一。近年来,对牦牛和藏绵羊疫病的防控主要集中于口蹄疫、布病以及小反刍兽疫等细菌性、病毒性传染病,对牦牛和藏绵羊梨形虫的调查一直是个空白。鉴于此,本试验针对梨形虫18S rRNA基因设计通用引物,对牦牛和藏绵羊梨形虫感染情况展开了调查,以确定阿坝州部分地区牦牛和藏绵羊梨形虫感染率及虫种。

1 材料与方法

1.1 实验材料 主要仪器设备和试剂：台式高速离心机(eppendorf 5402型)；Biometra TAdvanced 96SG PCR仪、2×EasyTaq PCR Super Mix(北京全式金生物科技有限公司)；全血DNA小量试剂盒(台湾Geneaid公司GS100)。

血液样本：采集时间为2016年9月到2016年10月,由省动物疫控中心负责采集,共采集抗凝血200份。由于条件所限,阿坝和金川只采集了牦牛血样,小金只采集了藏绵羊血样。样本信息如下：牦牛血样108份,其中红原20份,阿坝24份,壤塘16份,金川48份；藏绵羊血液样本92份,其中：红原20份,壤塘24份,小金48份。所有样本均来自牧区。

1.2 试验方法

1.2.1 全血DNA的提取 使用Geneaid公司全血提取试剂盒,按照说明书进行操作。

1.2.2 18S rRNA引物的设计 本试验中采用巢式PCR方法行进检测。第一轮反应中所用引物采用孙彩琴等[1]设计巴贝斯虫和泰勒虫通用引物序列如下,F1∶5′-GATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′,R1：5′-ATCGTCTTCGATCCCCTAACT-3′；第二轮反应引物 为 自 行 设 计,序 列 如 下 F2：5′-AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG-3′；R2： 5′-GAAAACATCCTT GGCAAATGCTTTCGC-3′,最终产物大小在750～810 bp之间。

1.2.3 梨形虫18S rRNA序列的PCR扩增、同源性分析及进化树构建 PCR反应条件：94℃预变性5 min；然后40个循环：94℃1 min,50℃30 s,72℃1 min；最后72℃延伸10 min。PCR产物克隆后送华大基因科技服务有限公司测序。运用Lasergene7.0软件对所测得的序列拼接、比对和同源性分析,分子进化树用MEGA 7构建。

2 结果

2.1 18S rRNA PCR检测 从牦牛和藏绵羊全血基因组DNA中成功扩增出梨形虫18S rRNA目的条带,片段大小约在800 bp,见图1。

图1 部分牦牛血液样本PCR反应后电泳图

2.2 牦牛和藏绵羊梨形虫感染率 牦牛和藏绵羊梨形虫感染率如表1所示,其中牦牛感染率分别为红原35%、壤塘100%、阿坝8.3%、金川8.3%,其中壤塘县牦牛感染率最高；藏绵羊感染率分别为红原60%、壤塘45.8%,小金95.8%,其中小金县藏绵羊梨形虫感染率最高。

表1 阿坝州牦牛和藏绵羊梨形虫感染情况

2.3 序列比对、进化树构建及分析 应用Lasergene7.0软件对克隆出的18S rRNA基因序列与其他泰勒虫18S rRNA的序列进行同源性分析(图2),应用Mega 6软件绘制系统发育进化树(图3)。由图2可见,来自阿坝、红原、金川和壤塘的牦牛感染的梨形虫均为中华泰勒虫(图2中对应序号分别为10、11、12/15),4个地区序列之间同源性为100%,与报道自甘肃、河南的中华泰勒虫(图2中对应序号分别为5、6、7)同源性为100%；来自小金、红原和壤塘的藏绵羊(图2中对应序号分别为9、10、14)均感染吕氏泰勒虫,其中壤塘和红原18S rRNA基因同源性为100%,小金和红原(壤塘)同源性为99.4%,与青海、宁夏等地报道的吕氏泰勒虫同源性在97.8～99.8之间(图2中对应序号分别为1、2、3、20、21)。 从建立的进化树可以看出(图3)牦牛感染的中华泰勒虫与国内报道的中华泰勒虫甘肃、河南株位于同一分支,进化关系比较近。藏绵羊感染的吕氏泰勒虫与国内外报道的吕氏泰勒虫均处于同一分枝,进化关系较近,但与青海株亲缘关系更近,处于同一分支上。

图2 泰勒虫18S rRNA基因同源性比较

图3 基于泰勒虫18S rRNA的进化树分析

3 讨论

阿坝藏族羌族自治州一直是牛羊梨形虫病的流行区[2-3],最早在1974年就有关于牦牛梨形虫病的报道,其中马尔康县5个乡牦牛死亡率高达90%[4]。1985年4月,金川县俄热乡和小金县新桥乡也发生梨形虫病,20余天死牛338头,其中牦牛309头,占91%[5]。据罗光荣等调查[6],1987年以后,在壤塘、松潘、阿坝县的半农半牧区,若尔盖、红原县牧区呈地方性散发流行,理县、九寨沟、汶川、茂县仅在饲养牦牛的山原区有零星散发。2005年冬季,阿坝州红原县龙日、安曲等部分乡的牦牛发生梨形虫病,导致4% ～7%的牦牛死亡,给当地畜牧业造成较大损失[7]。

可感染牛的梨形虫种类较多,包括环形泰勒虫、中华泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫以及大贝斯虫等；可感染羊的梨形虫包括莫氏巴贝斯虫、羊巴贝斯虫、泰氏巴贝斯虫、绵羊泰勒虫和山羊泰勒虫等。然而,到目前为止,一直未见对阿坝州牦牛和藏绵羊感染梨形虫种类的确切报道。本试验正是基于这一现状,采用巢式PCR方法对阿坝州红原、壤塘等5个县来自牧区的牦牛、藏绵羊进行了检测,发现牦牛梨形虫感染率为8.3% ～100%,感染虫种单一,均为中华泰勒虫；藏绵羊感染率为45.8% ～95.8%,感染虫种单一,均为吕氏泰勒虫。中华泰勒虫是白启等分离出的一种国内新的泰勒虫虫种[8],致病力较弱,用18S rRNA基因对其进行发育关系研究发现其与其他泰勒虫有明显的差异。本试验中,红原、壤塘、金川和阿坝州牦牛均感染中华泰勒虫,但均未发现有明显的临床症状,也间接说明中华泰勒虫可能是一种较为温和的血液原虫。吕氏泰勒虫传播媒介为长角血蜱和青海血蜱[9],青海血蜱是我国的特有种,分布于我国西部高原,主要包括青海、甘肃.四川、云南、西藏和宁夏等省[10]；长角血蜱则也是一种常见蜱种,分布于我国大多数省区[10]。因此,阿坝州较高的羊吕氏泰勒虫感染率(45.8%～95.8%)也可能和这两种蜱的广泛分布有关。

除此之外,采用巢式PCR鉴定虫种的过程中,200份样本中有107份只用第1对引物,即可扩出目的条带,剩下的样本采用第2对引物扩增后,也会出现较为明显的目的产物。值得注意的是,本试验初期也曾采用Lorien等使用的方法[11](巢式PCR,目的基因18S rRNA,产物1 700 bp左右),但经常会扩出与目的片段大小相近的齿脊肾形虫(Colpoda steinii)18S rRNA基因。经分析,该虫种广泛分布于青藏高原沼泽湿地中,牛羊在自由采食过程中很容易污染被毛,加之采血过程中,条件所限,无法彻底清洁采血部位,很有可能导致污染血样。所以,在孙彩琴等[1]第一对引物基础上,自行设计了第2对引物,经比对分析和临床样本测试,具有较好的特异性,彻底排除了齿脊肾形虫造成的干扰。

综上所述,本试验对阿坝州部分地区牦牛和藏绵羊梨形虫感染情况和感染虫种进行了调查,提供了分子依据。后期拟进一步扩大调查范围、样本数量以及对传播媒介蜱进行充分调查,为摸清阿坝州牦牛和藏绵羊梨形虫病基线提供技术支撑。