益生菌转化无机锌对蛋雏鸡免疫功能的影响

王金合,雷连成

(1.河南牧业经济学院动物医学院,河南 郑州 450046；2.吉林大学动物医学学院,吉林 长春 130062)

对蛋鸡免疫功能的评价,一是通过评价细胞免疫功能,主要评价T、B淋巴细胞的数量及活化程度；二是体液免疫评价,主要评价抗体效价；三是免疫器官变化,主要评价免疫器官指数胸腺、脾脏、腔上囊指数等的变化,其发育状况直接影响到动物机体的免疫力[1]；四是评价体液中的细胞因子、补体系统等变化。

益生菌能有效地提高巨噬细胞和干扰素的活性,是良好的免疫激活剂,能激发机体体液免疫和细胞免疫,导致动物机体免疫力的增强[2]。锌能够维持动物体免疫器官的正常组织结构和生长发育,低锌则引致禽类的腔上囊、胸腺、脾脏等免疫器官重量减轻、器官萎缩及生长发育不良；锌中毒状态时,黏膜表面sIgA减少,黏膜免疫功能削弱,缺锌对T淋巴细胞功能、B淋巴细胞的功能均有影响[3-4]。本试验通过益生菌将硫酸锌转化为有机锌,研究对蛋鸡免疫功能的影响,以期为临床开发应用富锌益生素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基

1.1.1 活化培养基和种子培养基 产朊假丝酵母活化培养基：蛋白胨 5.0 g、葡萄糖 10.0 g、酵母膏3.0 g、麦芽浸膏 3.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水1 000 mL,自然pH值；产朊假丝酵母种子培养基：蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、KH2PO42g,MgSO4·7H2O 0.3 g、蒸馏水1 000 mL,自然pH值。嗜酸乳杆菌活化培养基：10%脱脂乳培养基,自然pH值；嗜酸乳杆菌种子培养基：MRS肉汤培养基(上海易利生物科技有限公司)。凝结芽孢杆菌活化培养基：普通营养琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)；凝结芽孢杆菌种子培养基：葡萄糖60 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、蒸馏水1 000 mL,pH值7.5。

1.1.2 复合菌发酵培养基 参照文献[5],确定以上三种复合菌固体发酵培养基组成：麦麸18 g,玉米皮粉7.5 g,豆粕4.5 g,麦芽糖0.45 g,红糖0.74 g,NH4Cl 0.3 g,(NH4)2SO40.3 g,CaCO30.15 g,KH2PO40.29 g,MnSO40.08 g,MgSO40.15 g,自然pH值,含水量(即干物料质量∶水的体积)为1∶0.8。流通蒸汽灭菌。

1.1.3 计数培养基 GYP白亚琼脂培养基(嗜酸乳杆菌)、YPD固体培养基(产朊假丝酵母)、普通营养琼脂培养基(凝结芽孢杆菌)计数培养基,均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2 主要仪器 全自动酶标仪(美国BIO-TEK Synergy H1M)；超净工作台(苏州净化SW-CJ-2D)；二氧化碳培养箱(德国美墨尔特INC153med)；台式高速冷冻离心机(德国Sigma 3-k30)；立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂,LDZM-60KCS)等。

1.3 富锌活菌制剂的制备 选择产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌三种益生菌为生产菌。将产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌菌种分别接种于斜面活化培养基上连续活化2～3次；再按照3%接种量接种于种子培养基中。产朊假丝酵母30℃ 160 r/min摇床培养13 h,嗜酸乳杆菌37℃160 r/min摇床培养24 h。凝结芽孢杆菌37℃200 r/min摇床培养24 h,分别获得3种益生菌的种子液。配置锌浓度为50 mg/mL的硫酸锌溶液[6],121℃高压灭菌30 min后备用。将硫酸锌溶液按照1∶200的比例加入复合菌固体发酵培养基中,将产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌种子液接种比例按1∶1∶1接种于复合菌固体发酵培养基中,搅拌均匀后装入浅盘35℃培养36 h,浅盘表面及内层长满菌体后温度提高至60℃,加大风量,干燥后得到富锌益生素。检测其活菌数及有机锌转化率。

1.4 试验动物及分组 选取1周龄海蓝褐蛋鸡120只,试验随机分为4组(每组3个重复)：对照组(Ⅰ组)；试验(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)分别按照基础日粮的0.1%、0.15%、0.2%比例添加富锌益生素。试验时间为55 d,其中预试验5 d。常规饲养管理,蛋鸡基础日粮由新希望集团提供,饲喂方式采用自由采食和自由饮水,试验地点位于河南省驻马店某蛋鸡场。

1.5 检测指标和方法

1.5.1 活菌数及有机锌转化率检测取10 g富锌益生素,用灭菌生理盐水做10倍梯度稀释,分别取不同稀释度益生素稀释液0.1 mL,均匀涂布于不同菌种固体培养基,每个稀释度3个重复,以每个平板上生长30～300个菌落作为计数标准,培养后活菌计数。有机锌转化率测定参照文献[7]的方法,采用原子吸收分光光度法测定锌含量。富锌益生素1∶5稀释后,3000 r/min离心8 min,分别测定沉淀物和上清液锌含量,有机锌转化率=沉淀物锌含量/总锌含量×100%。

1.5.2 免疫器官指数 分别在21、42日龄,每组随机选取4只鸡,称重扑杀,采集胸腺、腔上囊、脾脏。计算出胸腺、脾脏、腔上囊的免疫器官指数。免疫器官数=免疫器官重(mg)/体重(g)。

1.5.3 血清补体C3、C4、IL-2、IFN-γ含量的检测分别在21日龄、28日龄、35日龄,每组随机抽取4只鸡,采取翅静脉采血,每只采集5 mL血液,分离血清,检测血清补体 C3、C4、IL-2、IFN-γ含量。 补体C3、C4、IFN-γ 的含量用通蔚试剂(上海)有限公司ELISA试剂盒测定；IL-2使用上海钰博生物科技有限公司试剂盒测定；检测方法按照说明书进行。

1.5.4 外周血T、B淋巴细胞转化率 血液淋巴细胞转化率用MTT法测定。在21日龄和42日龄每个重复选取2只健康蛋雏鸡,翅静脉采集抗凝血5 mL,分离出淋巴细胞,分别用 Con A、LPS(南京生兴生物技术有限公司)为T淋巴细胞的刺激源、B淋巴细胞的刺激源。将分离的T、B淋巴细胞在CO2恒温培养箱中,培养48小时,酶标仪测定OD值(570 nm),计算淋巴细胞刺激指数(SI)=丝裂原刺激OD值/对照OD值,以淋巴细胞刺激指数(SI)表示结果。

1.5.5 体液免疫水平的测定(对ND影响) 试验用雏鸡于8日龄、22日龄用鸡新城疫活疫苗(LaSota株,乾元浩生物股份有限公司)免疫,滴鼻点眼(2羽份)；分别于28日龄、42日龄、56日龄采血分离血清,采用HI试验检测鸡ND抗体效价,结果以log2表示。

1.6 数据处理 试验数据采用SPSS15.0软件统计,单因子方差(One-WayANOVA)分析进行差异显著性检验,用 Duncan法进行多重比较。结果以平均数±标准误表示。

2 结果

2.1 富锌益生素活菌数及锌转化率 产朊假丝酵母每克含活菌5.20×108CFU/g,嗜酸乳杆菌每克含活菌6.40×108CFU/g,凝结芽孢杆菌每克含活菌7.91×109CFU/g,富锌益生素总活菌数为9.07×109CFU/g,有机锌转化率为76.82%。

2.2 免疫器官指数 由表1可知,21日龄和42日龄,益生素添加组的脾脏指数、腔上囊指数、胸腺指数均高于对照组。21日龄时,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的脾脏指数分别高出Ⅰ组 9.47%(P＞0.05)、22.1%(P＜0.05)、23.51%(P＜0.05)；胸腺指数分别高出Ⅰ组7.94%(P ＞0.05)、16.33%(P ＜0.05)、19.86%(P＜0.05)；腔上囊指数分别高出Ⅰ组2.48%(P＞0.05)、9.94%(P ＞0.05)、16.57%(P ＜0.05)。 42日龄时,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的脾脏指数分别高出Ⅰ组2.48%(P ＞0.05)、7.12%(P ＞0.05)、13.03%(P＞0.05)；胸腺指数分别高出Ⅰ组1.70%(P＞0.05)、7.18%(P ＞0.05)、10.39%(P ＞0.05)；腔上囊指数分别高出Ⅰ组0.48%(P＞0.05)、1.19%(P ＞0.05)、6.22%(P ＞0.05)。

表1 富锌益生素对蛋鸡免疫器官指数的影响

2.3 血清补体 C3、C4、IL-2、IFN-γ含量 由表2可知,C3、C4检测值各组在21日龄、28日龄、42日龄变化不明显(P＞0.05)。相同日龄富锌益生素添加组和对照组相比,C3含量显著提高(P＜0.05)；IL-2检测值在21日龄、28日龄、42日龄Ⅰ组、Ⅱ组变化不大(P＞0.05),Ⅲ组42日龄显著提高(P＜0.05),Ⅳ组在28日龄、42日龄显著提高(P＜0.05)；同日龄IL-2检测值,Ⅲ组、Ⅳ组对Ⅰ组、Ⅱ组均有显著提高(P＜0.05)。IFN-γ检测值Ⅰ组在21日龄、28日龄、42日龄变化不大(P＞0.05),Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组对Ⅰ组均有显著提高(P＜0.05)；同日龄IFN-γ检测值,21日龄、28日龄Ⅳ组在对其他各组均有显著提高(P＜0.05),在42日龄,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组均对Ⅰ组有显著提高(P＜0.05)。

表2 富锌益生素对血清补体C3、C4、IL-2、IFN-γ含量的影响

2.4 外周血T、B淋巴细胞转化率 由表3可知,21日龄、42 d的Ⅲ组、Ⅳ组的T淋巴细胞转化率显著高于对照组Ⅰ和试验Ⅱ组(P＜0.05)；B淋巴细胞转化率各组差异均不显著(P＞0.05)。

表3 富锌益生素对蛋鸡淋巴细胞增殖活性的影响

2.5 对ND抗体水平的影响 由表4可知,Ⅲ组、Ⅳ组ND的HI抗体效价在42日龄、56日龄显著高于对照组(P＜0.05)。

表4 富锌益生素对ND抗体水平的影响

3 讨论

有益菌在肠道内大量繁殖并不断合成有益物质,能够促进动物免疫器官生长发育,能够发挥免疫佐剂的作用,活化机体免疫系统,调节免疫功能[8]。适量的锌对免疫机能必不可少,能够保证免疫系统的完整性,对动物机体免疫功能的稳定起着重要的作用,锌严重缺乏影响动物免疫器官生长发育,影响胸腺素生物学活性作用的发挥[9]。卢昊等[10](2010)发现,在肉鸡日粮饲料中添加谷氨酸络合锌,脾脏指数和胸腺指数显著高于对照组。本试验结果表明,添加富锌益生素增加机体免疫功能。益生素添加组的脾脏指数、腔上囊指数、胸腺指数均高于对照组,提高了蛋雏鸡血清C3、C4 含量,能显著提高 IL-2、IFN-γ 含量,表明富锌益生素能促进机体补体产生。IFN-γ含量的提高,活化了T淋巴细胞和NK细胞产生,提高了单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力、增强了Tc细胞和NK细胞的杀伤活性、抗病毒和抗肿瘤等作用。IL-2含量的提高,活化了T淋巴细胞,促进细胞因子产生,刺激NK细胞增殖,增强NK杀伤活性及产生细胞因子,诱导LAK细胞产生；促进B淋巴细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞[11]。当淋巴细胞受到抗原或丝裂原(如 Con A、LPS)等刺激后,引起淋巴细胞的代谢和形态发生改变,转化成淋巴母细胞发生分裂增殖,根据T、B淋巴细胞的转化率可以判定机体的体液免疫和细胞免疫状况[12]。张春善等[13](2000)补锌能提高淋巴细胞PHA刺激转化率。赵波等[14](2005)研究表明,蛋氨酸锌可提高蛋鸡的T淋巴细胞转化率。吕英[15](2003)研究表明,乳酸菌可以激活免疫细胞,提高外周血液中T淋巴细胞的增殖,提高细胞免疫水平。抗体滴度水平的高低反应了家禽的健康状况和体液免疫的强弱[16]。闫素梅等[17](2002)研究发现,艾维茵肉鸡锌的缺乏,可导致机体体液免疫水平下降,补锌能够提高肉鸡免疫功能。王斯佳[18](2002)发现,日粮锌水平对鸡血清ND抗体滴度,具有显著影响。王明发等[19](2016)研究发现,随着锌添加水平的提高,AA肉鸡和固始鸡ND抗体水平提高极显著。本试验结果表明,蛋鸡日粮中添加富锌益生素能显著提高外周血T淋巴细胞转化率和ND抗体水平,与上述报道基本一致。

4 小结

结果表明,蛋鸡日粮添加富锌益生素提高了脾脏指数、腔上囊指数、胸腺指数及血清 C3、C4、IL-2、IFN-γ的含量,能够增强蛋雏鸡的免疫功能。