转录活性蛋白1在实验性近视眼豚鼠巩膜重塑中对I型胶原表达的调控作用△

朱子诚 展欣 张楚 刘夏薇 应充慧 孙思勤 柯根杰

在学龄儿童及青少年全球屈光性疾病中，近视的发病率位居首位，尤其在亚洲及东南亚地区的城市中最为明显，近视的防治问题已成为当今社会的热点。目前普遍认为，近视是遗传因素与环境因素共同作用的结果[1-2]。在分子生物学不断发展进步的今天，越来越多的生物活性分子被发现在近视巩膜重塑中发挥重要作用，如转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)[3-5]。以往的研究表明[6-8]，作为TGF-β1的下游信号转录因子，转录活性蛋白1(specificity protein 1，Sp1)通过与Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)前体结构上某些特殊区域的靶向结合而影响其合成及降解。但Sp1在近视巩膜重塑过程中的表达与作用如何尚未见文献报道。基于此，本研究拟用豚鼠建立形觉剥夺性近视(form deprivation myopia，FDM)模型，观察正视眼和实验性近视眼巩膜中Sp1和Collagen Ⅰ的动态表达变化以及两者的关系，以进一步揭示TGF-β1信号通路在近视巩膜重塑中的作用机制，为进一步研究近视防治措施提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组、造模选取出生7 d、体质量为100～140 g的健康新生有色豚鼠75只(购于安徽省立医院实验动物中心)，排除先天性近视及其他眼部疾病，于室内温度22 ℃、12 h照明环境下饲养。随机选取50只建立FDM模型，其中遮盖眼为FDM组，对侧未遮盖眼为自身对照组，另外25只不作处理作为正常组。FDM模型建立方法：6号无色半透明乳胶气球套住豚鼠头部，气球遮盖左眼，用缝线将颈部的气球部分固定，避免眼罩滑落及旋转；对侧眼暴露。所有实验均依照实验动物保护和使用健康指南进行，并经我院医学伦理委员会批准。

1.2 观察指标及方法

1.2.1 屈光度及眼轴长度各组分别于遮盖后0周(遮盖前)、2周、4周、6周及遮盖4周去遮盖1周(4/-1周)托吡卡胺充分散瞳，暗室内带状光检影验光。然后用5 g·L-1盐酸丙美卡因滴眼行表面麻醉，采用A超以手动模式连续测量双眼眼轴长度(角膜内皮顶点至后极部视网膜前界膜的距离)3次，取平均值记录。

1.2.2 取材FDM组于遮盖后0周、2周、4周、6周及4/-1周各取10只豚鼠使用过量的10 g·L-1戊巴比妥钠腹腔注射处死，正常组于实验6周时统一处死，摘出眼球放在提前备好的冰块上，去除眼前节，清除玻璃体、视网膜及脉络膜，取后极部巩膜组织分别行Western blot和RT-PCR检测。

1.2.3 Western blot检测巩膜中Sp1和Collagen Ⅰ蛋白表达取巩膜行组织匀浆和蛋白提取，常规上样、电泳、转膜，50 g·L-1脱脂牛奶封闭；加入一抗(Sp1抗体：兔抗，1500稀释，美国Bioworld公司；Collagen Ⅰ 抗体：兔抗，1300稀释，博士德公司)，4 ℃孵育12 h，后加入按15000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育2 h后使用ECL发光试剂盒(Thermo公司)检测Sp1和Collagen Ⅰ 蛋白表达。北京科创瑞欣生物凝胶成像系统分析结果并拍照。

1.2.4 RT-PCR检测巩膜中Sp1和Collagen Ⅰ mRNA表达取巩膜组织，按Trizol实验步骤提取总RNA，逆转录，以cDNA为模版用Sp1、Collagen Ⅰ基因引物进行RT-PCR扩增(QuantiFast SyBr Green PCR kit，Qiagen)，以β-actin作参照，引物序列见表1。Sp1反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃ 延伸10 min至4 ℃。Collagen Ⅰ反应条件：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min至 4 ℃。取适量产物与上样缓冲液一起进行琼脂糖凝胶电泳。利用凝胶成像系统观察结果并拍照。分析巩膜内靶基因的mRNA相对表达量。

表1 基因引物序列

基因上游引物下游引物产物长度/bpSp15’-GCATATTTGCCACATCCAAG-3’5’-CTTCCATGGCTACCATGTTG-3’383Collagen Ⅰ5’-CCATTGGGCTTATGATACCC-3’5’-GAACAGACAGCTCTCCCACA-3’428β-actin5’-GCTCTATCCTGGCCTCACTC-3’5’-GGGTGAGGGACTTCCTGTAA-3’400

2 结果

2.1 屈光度和眼轴长度豚鼠在出生时双眼呈远视状态，眼轴相对短小，各组屈光度和眼轴长度差异均无统计学意义(均为P>0.05)。随时间延长，FDM组豚鼠的屈光状态逐渐由远视变成近视，且眼轴增长明显；正常组和自身对照组豚鼠屈光度和眼轴长度均变化缓慢。遮盖后2周、4周、6周及4/-1周，FDM组屈光度及眼轴长度与自身对照组及正常组比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表2。

表2 各组豚鼠不同时间点屈光度和眼轴长度比较

遮盖时间屈光度/D正常组自身对照组FDM组眼轴长度/mm正常组自身对照组FDM组0周2.18±0.262.10±0.312.08±0.305.86±0.325.85±0.375.90±0.382周1.38±0.25∗1.26±0.28∗-1.22±0.676.20±0.30∗6.23±0.32∗6.61±0.354周0.60±0.22∗0.56±0.26∗-4.15±0.566.52±0.30∗6.57±0.30∗7.28±0.324/-1周0.70±0.40∗0.82±0.28∗-3.67±0.586.36±0.31∗6.59±0.36∗7.16±0.346周-0.14±0.25∗-0.30±0.25∗-6.07±0.566.80±0.28∗6.96±0.33∗7.89±0.30

注：与FDM组比较，*P<0.05

2.2 Sp1和Collagen Ⅰ蛋白表达情况各组巩膜组织均有Sp1和Collagen Ⅰ蛋白的表达，FDM组随遮盖时间延长，Sp1和Collagen Ⅰ蛋白的表达量逐渐下降，去除遮盖1周后，Sp1和Collagen Ⅰ蛋白的表达量均有上升趋势。正常组Sp1和Collagen Ⅰ蛋白相对表达量分别为1.864±0.014、2.922±0.005；遮盖后0周、2周、4周、4/-1周、6周，FDM组Sp1蛋白相对表达量分别为1.856±0.016、1.215±0.016、0.752±0.013、0.945±0.017、0.518±0.012，Collagen Ⅰ蛋白相对表达量分别为2.836±0.001、2.336±0.002、1.500±0.003、1.754±0.006、1.082±0.001。遮盖后2周、4周、6周及4/-1周，FDM组与正常组间Sp1和Collagen Ⅰ蛋白相对表达量差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图1。

图1 FDM组和正常组巩膜中Sp1和Collagen Ⅰ蛋白的表达情况。与正常组比较，*P<0.05

2.3 Sp1和Collagen Ⅰ mRNA表达情况各组巩膜组织均有Sp1和Collagen Ⅰ mRNA的表达，FDM组随遮盖时间延长，Sp1和Collagen Ⅰ mRNA的表达均逐渐下调，去除遮盖1周后，Sp1和Collagen Ⅰ mRNA的表达均上调。遮盖后2周、4周、6周及 4/-1 周，FDM组与正常组间Sp1和Collagen Ⅰ mRNA的表达量差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图2和表3。

2.4 Sp1和Collagen Ⅰ表达的相关性分析Pearson相关性分析结果表明，在近视巩膜组织中，Sp1与Collagen Ⅰ蛋白和mRNA表达均有显著相关性(均为r=1.00；P蛋白=0.01、PmRNA=0.00)。

图2 FDM组和正常组巩膜中Sp1和Collagen Ⅰ mRNA的表达情况

组别Collagen ⅠSp1正常组1.071±0.0140.599±0.025FDM组 遮盖后0周1.010±0.0210.557±0.024 遮盖后2周0.947±0.006∗0.510±0.013∗ 遮盖后4周0.626±0.010∗0.349±0.013∗ 遮盖后4/-1周0.770±0.020∗0.457±0.009∗ 遮盖后6周0.331±0.004∗0.168±0.012∗

注：与正常组比较，*P<0.05

3 讨论

在近视的发生发展进程中，巩膜重塑起到至关重要的作用，其表现的结果是眼球屈光状态和形态变化，尤其是眼轴前后径过度延长[9-10]。研究表明[11-12]，占巩膜净重90%的是胶原纤维，主要包括Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及Collagen Ⅳ，其中Collagen Ⅰ在巩膜中占有最大比例，在近视巩膜重塑中胶原的表达都是下降的，尤其是Collagen Ⅰ。在近视发展过程中，TGF-β在巩膜重塑过程中起重要作用，TGF-β三种亚型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)的表达都是降低的[3，5，13]。体外研究证实，TGF-β1是三种亚型中最能增强巩膜成纤维细胞增殖能力的生长因子[14]。

在其他诸多领域已证实，Sp1是TGF-β1的下游因子[6-8]。Sp1通过与Collagen Ⅰ前体结构上某些特殊区域的靶向结合而影响其合成及降解。但在眼科领域，Sp1在近视巩膜重塑过程中的表达与作用如何尚未见文献报道。本研究旨在初步探讨近视巩膜中Sp1的表达及其与Collagen Ⅰ的关系。

以往的研究证明[3]，随着近视度数的加深，在近视巩膜胶原合成与降解过程中，TGF-β1和Collagen Ⅰ的表达逐渐下调，且两者之间存在一定的正相关。本研究结果显示，随着遮盖时间的不断延长，Collagen Ⅰ蛋白和mRNA表达均呈逐渐下降的趋势，且在遮盖4/-1周时，FDM组Collagen Ⅰ的蛋白和mRNA表达量与遮盖4周相比有所增加，与遮盖2周相比有所降低，这表明随着遮盖时间的延长和近视度数的加深，Collagen Ⅰ的表达是逐渐下降的，与文献结果[3]一致。

Sp1属于特异性蛋白/Krüppel样因子(Sp/xklf)转录因子家族，其含有3个保守的Cys2His2锌指DNA结合位点，这些锌指结构损坏不仅影响DNA的结合能力，同时也影响核转位。Sp1在哺乳动物细胞中表达并调节细胞功能，如细胞生长、增殖、代谢等[6，15-16]。Yu等[17]研究表明，青光眼术后miR-29b通过Sp1-Collagen Ⅰ信号通路抑制滤过泡纤维细胞增殖，从而获得良好的滤过功能和稳定的眼压。而miR-29b是TGF-β1信号通路的抑制因子[18]。本研究结果显示，Sp1在近视巩膜组织中的表达曲线与Collagen Ⅰ相似，即随遮盖时间延长，Sp1的表达也是逐渐下降的，去遮盖后表达上调。经Pearson线性相关分析，Sp1与Collagen Ⅰ的蛋白和mRNA表达量均有明显的相关性。本研究结果提示，Sp1和Collagen Ⅰ在近视巩膜重塑过程中可能存在联系，Sp1可能通过与Collagen Ⅰ的前体组成部分Col1α1链上特殊区域结合，从而影响Collagen Ⅰ的合成与降解，进而调控巩膜重塑过程。

本研究结果证实，在豚鼠实验性近视眼巩膜中Sp1和Collagen Ⅰ均有表达，在近视巩膜重塑过程中两者可能存在一定联系，随着近视度数的不断加深，二者在巩膜中的表达都逐渐下降。由此可以推测，Sp1信号转录因子可能通过TGF-β1-Sp1-Collagen Ⅰ信号轴在近视巩膜重塑中发挥重要作用，这将为近视发病机制及防治等相关研究提供新的思路和方向。