普通白菜作为替代基质解决液相色谱-串联质谱基质效应的可能性

吴淑春，程珊莉，梁赤周，狄珊珊，虞淼，徐永，王新全，韩剑众

(1.浙江工商大学 食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018； 2.杭州医学院，浙江 杭州 310053；3.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 4.浙江省农药检定管理总站，浙江 杭州 310020)

农药残留一直是农产品质量安全所关注的焦点问题[1-2]，不仅对人们的身体健康有着不可忽视的威胁力，同时对中国农产品的出口带来非常大的影响。基质效应是农药残留检测中重要的影响因素之一，由于基质效应的存在，使得农药残留检测的结果准确度有所降低，会影响目标化合物的峰形、响应值，进而影响方法的准确度及灵敏度[3]，因此减小基质效应的影响至关重要。目前，QuEChERS方法成为农药残留分析中的常用方法，能够有效减少有机溶剂的使用，使样品前处理步骤得到简化、节约时间，适合于气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析[4-5]。为了提高分析结果的精准度，越来越多的研究致力于降低或消除基质效应[6-8]。基质匹配标样为解决基质效应的首选方法，但由于蔬菜、水果种类众多，筛选每种样品的空白基质将耗费大量的人力和物力，同时兼顾检测效率，因此很难一一匹配进行基质匹配标准溶液定量。选择一种合适的替代基质匹配标准溶液辅助溶剂标准溶液进行定量，将解决大部分由基质效应导致的定量问题。因此，本研究选择11种代表性的蔬菜、水果和食用菌样品，经QuChERS方法处理后，LC-MS/MS分析39种农药的基质效应。通过对比，利用主成分分析(PCA)筛选适合作为替代基质的样品，系统的评价其辅助溶剂标准溶液解决基质效应的可能性。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

液相色谱-串联质谱(AB 4500，AB-SCIEX)；台式离心机(Thermo)；Filter Unit滤膜(0.22 μm)。分析纯氯化钠、无水硫酸镁等均购自华东医药有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯， Merck)；甲酸铵HPLC级(Tedia)；PSA、C18(Agela Technologies)；实验用水为超纯水。39种农药分析标准品购于上海农药研究所或农业部环境保护科研监测所。选择的代表性蔬菜样品为芹菜、普通白菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜、韭菜，水果样品为苹果、葡萄、草莓，食用菌样品为金针菇。

1.2 QuChERS方法的样品前处理过程

称取样品(10.00±0.05)g于50 mL离心管中，准确加入10 mL乙腈，涡旋1 min，然后加入1.5 g NaCl和4 g无水MgSO4，涡旋1 min，7 000 r·min-1离心3 min，准确移取乙腈萃取上清液1 mL加入到含有50 mg PSA、50 mg C18和0.15 g无水MgSO4的2 mL离心管中，剧烈震荡后涡旋1 min， 7 000 r·min-1离心3 min。取0.5 mL上清液转移至含有0.5 mL水的离心管(2 mL)中，混匀，过0.22 μm滤膜，待LC-MS/MS分析。

1.3 标准溶液配制

基质匹配标准溶液配制。用空白基质提取液将化合物混标逐级稀释成浓度为160、120、80、40、10和1 μg·L-1的基质匹配标准溶液。

溶剂标准溶液配制。用乙腈/水(1∶1，V∶V)溶液将化合物混标逐级稀释成浓度为160、120、80、40、10和1 μg·L-1的溶剂标准溶液。

1.4 LC-MS/MS分析方法

基于LC-MS/MS(AB 4500)分析样品中的39种农药。色谱柱为Kromasil 100-C18(2.1×100 mm，1.8 μm)，流动相为A：甲醇，B：5 mmol·L-1乙酸铵和0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序为0.0 ～ 2.0 min，80%B，10.0 min，5%B，13.5 min，5%B，13.6 min，80%B，16.0 min，80%B。流速为0. 35 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量2 μL。

质谱条件。采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，加热温度450 ℃，喷雾电压为正源5 500 V，负源4 500 V。化合物质谱参数如表1所示。

表1 目标化合物的LC-MS/MS参数

注：*为定量离子。

2 结果与分析

2.1 样品中39种农药的基质效应评价

基质效应是农药残留检测中重要的影响因素之一，可能对目标物的检出造成一定的影响，导致出现假阳性、灵敏度降低等结果。样品中除分析物外其他所有组分的存在会影响分析物的电离效率，减小或者增大分析物的响应值，被称作基质效应[9]。基质匹配标准溶液曲线方程斜率与溶剂标准溶液曲线方程斜率比(Slope ratio，SR)为评价基质效应的常用方法，可用比值或其百分数表示。若SR=100，表明无基质效应；若SR<100，为基质抑制效应；若SR>100，为基质增强效应。当80%≤SR≤120%时，为弱基质效应，对结果定量影响不大；当50%≤SR<80%或120%150%，为强基质效应，将严重干扰结果定量。

11种代表性样品经QuEChERS方法处理后，LC-MS/MS分析结果表明(图1)，选择的蔬菜、水果和食用菌样品均存在基质效应，并以基质抑制为主，约75%化合物基质效应为抑制，25%为增强，其中22.4%为中等抑制效应，6.6%为强抑制效应，6.4%为中等增强效应，1.5%为强增强效应。基质效应较强的化合物分别为灭蝇胺、涕灭威、多效唑、虫酰肼、灭幼脲、吡唑嘧菌酯、甲维盐和阿维菌素。

图1 不同样品经QuEChERS方法处理后经 LC-MS/MS测定时的基质效应

进一步分析结果如图2所示，11种代表基质中弱基质效应为64%，中等基质效应为28.8%，强基质效应为7.2%。其中芹菜、普通白菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜、韭菜、苹果、葡萄、草莓和金针菇中等基质效应的化合物分别为30.8%、28.2%、12.8%、28.2%、25.6%、48.7%、43.6%、28.2%、12.8%、15.4%和38.5%，强基质效应分别为5.1%、5.1%、7.7%、7.7%、5.1%、28.2%、20.5%、2.6%、2.6%、2.6%和0。在所选的基质中，大蒜和韭菜的基质效应较强，不适合作为替代基质；芹菜、普通白菜、豇豆、辣椒、苹果的基质效应分布相似，弱基质效应为主，中等基质效应其次，存在少量的强基质效应，可以尝试作为替代基质，但仅通过数据比较很难筛选；金针菇样品仅存在弱和中等基质效应，而番茄、葡萄和草莓样品的基质效应均较弱，不能代表大多数样品的基质效应情况，不适合作为替代基质。单纯的数据分析存在一定的偏差性，很难筛选合适的替代基质。本研究采用主成分分析(PCA)方法进一步的分析确证，以期找到合适的替代基质。

图2 基质效应评价

2.2 替代基质匹配标准溶液的筛选及基质效应评价

通过PCA分析(图3)可以发现，大蒜和韭菜较为分散，与其较强的基质效应结果一致；其他蔬菜和水果较为集中，其中普通白菜处于中间位置，可以尝试作为替代基质进行研究。如图2所示，选择普通白菜作为替代基质匹配标准溶液时，中等和强基质效应有明显改善，其中普通白菜全部改善，芹菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜和韭菜香蕉分别改善了50.0%、12.5%、50.0%、58.3%、23.3%和24.0%；但苹果、葡萄、草莓、金针菇基质效应没有改善，故普通白菜不适合用于水果和食用菌样品的基质效应校正。除去这4种基质，其他代表性基质样品的中等和强基质效应均有明显降低，中等基质效应由31%降至16%，强基质效应由11%降至8%。但选择普通白菜作为替代基质时，氯虫苯甲酰胺的基质效应明显增强，由弱抑制基质效应变成强增强基质效应，将严重影响结果准确度。由于PCA分析中大蒜和韭菜较为分散，普通白菜作为替代基质使大蒜和韭菜的基质效应改善明显，分别改善了23%和24%，但2种蔬菜和其他代表性蔬菜、水果、食用菌相比，基质效应仍然较强。综上，在分析代表性的蔬菜样品中农药残留分析时，选用白菜基质辅助溶剂标准溶液进行校正，可改善中等和强基质效应问题，但不适用于水果和食用菌样品，对于受基质影响显著的化合物建议使用同种样品基质匹配标准溶液进行定量分析。

图3 通过PCA评价代表性蔬菜、水果和 食用菌样品基质效应

3 小结

本研究对11种代表性的蔬菜、水果和食用菌样品中39种农药，选用QuChERS进行前处理后，结合LC-MS/MS分析评价不同农药的基质效应差异。结果表明，化合物基质效应以基质抑制为主，约75%为抑制，25%为增强，其中中等基质效应为28.8%，强基质效应为7.2%。选择普通白菜作为替代基质匹配标准溶液时，蔬菜水果样品的中等和强基质效应均有不同程度的改善，普通白菜、芹菜、番茄、豇豆、辣椒、大蒜和韭菜的基质效应分别改善了100.0%、50.0%、12.5%、50.0%、58.3%、23.3%和24.0%，但苹果、葡萄、草莓、金针菇的基质效应没有改善。除去这4种基质，其他代表性基质样品的中等和强基质效应均有明显降低，中等基质效应由31%降至16%，强基质效应由11%降至8%。因此，选用普通白菜基质匹配标准溶液在农药残留分析时辅助溶剂准溶液标进行校正，可改善蔬菜样品的中等和强基质效应，但对于受基质影响显著的农药建议使用同种样品基质匹配标准溶液进行定量分析。