苦参碱抑制HepG2肝癌细胞的靶点——ERK信号通路

康生朝 杨婉 郑英 卢利霞 熊婉媛 董敏 于晓辉

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的高度恶性肿瘤，其死亡率在恶性肿瘤中排第二位，并且在中国的死亡率还在逐年增长[1-2]。信号转导是细胞间信号传递的必要过程，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)作为MAPK家族的信号转导蛋白，广泛存在于各种组织，参与细胞的增殖分化，多种生长因子受体、营养相关因子受体等都需要ERK的活化来完成信号转导过程。ERK包括了两种异构体ERKl和ERK2，其激活对于Ras诱导的细胞反应、转录因子的激活以及激酶的激活至关重要。前期研究发现，ERK在HCC组织中高表达，提示HCC的发生与ERK信号通路相关[3]，可以抑制HCC细胞的增殖、迁移。因此，探索苦参碱是否以ERK信号通路上的ERK蛋白为靶点抑制HCC细胞生长，一方面可以为苦参碱的抗癌作用提供分子理论基础，另一方面可以为中药的谴方用药及中药分子靶向领域治疗肝癌提供新思路[4]。

资料和方法

一、细胞来源

实验采用人HepG2肝癌细胞系，于2014年9月购自中国科学院上海生物研究所，以液氮冻存包装送达实验室后，立即置于-80℃冰箱保存以备用。

二、主要试剂

苦参碱(上海Aladdin公司)，ERK1/2单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，PCR试剂盒(日本Takara公司)，Western-Blot试剂盒(英国Abcam公司)，RPMI-1640细胞培养基。

三、主要器材

96孔、24孔、6孔细胞培养板，移液器(0.5～10 μL、10～100 μL、 100～1 000 μL、1 000～5 000 μL)。

四、研究方法

(一)RT-PCR检测 分别提取终浓度为1、2、4 mg/mL苦参碱干预和20 μL PD98059干预后的细胞总RNA，在冰上加入裂解液裂解细胞，4℃离心机分离RNA，加入10 μL RNase-free水溶解RNA。用5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)、Total RNA、RNase Free dH20混合成cDNA工作液，经37 ℃、85 ℃和4 ℃温度变化合成cDNA。ERK上游引物序列为：5′-TATGCTAATCCTGCTGTGTT-GTCTA-3′，下游引物序列为：5′-AAATGTTGTG-CAGGCGAATG-3′；β-actin引物序列为：5′-GCACC-GTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列为：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。依照该引物序列进行ERK核酸的逆转录PCR反应。测得Ct值用2-ΔΔCt(Livak)处理后进行统计学检验来分析RT-PCR产物。

(二)Western-Blot检测 提取各组蛋白，并进行蛋白定量，绘制标准曲线，根据标准品曲线计算出样品的蛋白浓度。灌注浓缩胶和分离胶进行电泳、转膜后，封闭一抗，4℃冰箱过夜，再孵二抗。按照ECL A∶ECL B=1∶1比例混匀进行化学发光，把载有PVDF膜的玻璃板置于凝胶成像分析仪中，用凝胶成像处理系统分析目标蛋白分子量和净光密度值。

五、统计学方法

数据采用SPSS17.0软件处理，结果以(均数±标准差)表示，P<0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

一、苦参碱抑制HepG2细胞中ERK mRNA的表达

经苦参碱作用后ERK mRNA的表达量显著下降，4 mg/mL、2 mg/mL与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，而1 mg/mL与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；与阳性对照组比较，4 mg/mL、2 mg/mL差异有统计学意义(P<0.05)，而1 mg/mL差异无统计学意义(P>0.05)。说明4 mg/mL、2 mg/mL明显抑制HepG2细胞ERK核酸的表达(见图1)。

注：*为与空白对照组比较P<0.05；△为与阳性对照组(PD98059)比较P<0.05；#为实验组组间比较4 mg/mL与1 mg/mL和2 mg/mL差异有统计学意义，P<0.05，1 mg/mL和2 mg/mL差异无统计学意义

二、苦参碱抑制HepG2细胞中ERK及p-ERK蛋白含量的表达

与空白对照组相比，p-ERK水平随着苦参碱浓度的增加而下调；2 mg/mL、4 mg/mL苦参碱作用后表达的蛋白与空白对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)，而1 mg/mL苦参碱作用后p-ERK的蛋白表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；1 mg/mL、2 mg/mL作用后p-ERK的表达量与阳性对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)，而4 mg/mL作用后的蛋白表达量与阳性对照组无差异。见表1和图2。

表1 Western blot方法检测ERK及p-ERK蛋白表达

注：灰度值统计方法为：测量积分光密度，积分光密度=条带面积×平均密度；*为实验组与空白对照相比，P<0.05，**<0.01；△为实验组与阳性对照组相比，P<0.05，△△<0.01

注：灰度值统计方法为：测量积分光密度，积分光密度=条带面积×平均密度

讨 论

苦参碱是目前临床上选择的高效低毒药物，研究发现其对多种肿瘤如胆囊癌、骨肉瘤等均有重要作用，主要参与抑制肿瘤增殖与凋亡[5]。前期研究已证实苦参碱可以抑制HepG2肝癌细胞增殖及迁移[6]。此外，苦参碱对肝癌的抑制作用已经应用于临床，有体外研究认为，不同的苦参碱衍生物对不同的肝癌细胞有特异性[7]，其间更深层的机制可能是通过ERK信号通路实现。

ERK信号转导通路在HCC发生发展中起着传播和放大信号的作用[8]，主要传递上皮和间叶细胞中的信号，同时在化学治疗中起着重要作用[9]。很多研究报道通过ERK信号转导通路可以调控HCC的发生发展[10]。因此该条转导通路上的关键蛋白ERK备受关注。本研究选用苦参碱，试图降低ERK及p-ERK在肝癌细胞中的表达。采用免疫荧光印迹法和Real-Time PCR法，从转录水平和蛋白水平检测苦参碱对ERK关键蛋白的影响以及对ERK信号转导通路的作用。苦参碱干预后，ERK核酸表达量随着苦参碱浓度的增加而下降，ERK蛋白的表达趋势与转录水平的mRNA ERK趋势一致，说明当苦参碱作用于HepG2细胞后，ERK信号通路的活性丧失，HCC细胞无法通过该条通路传递相应的增殖及迁移信号，从而发挥对HCC的抑制作用。在Western-Blot检测中，苦参碱与阳性对照组PD98059相比，阻断ERK信号转导通路的效应以4 mg/mL浓度为最强，ERK及p-ERK表达量在4 mg/mL浓度时最低，且用4 mg/mL苦参碱作用HepG2肝癌细胞后与阳性对照组PD98059的差异无统计学意义，说明苦参碱可能存在与PD98059类似的阻断ERK效应。

本研究提示苦参碱抑制HCC的分子机制是通过下调ERK的核酸及蛋白表达水平抑制ERK信号通路。而ERK可以成为苦参碱的治疗靶点，为苦参碱的分子靶向治疗提供理论依据。