SRPX2对肝癌细胞侵袭与迁移能力的影响及作用机制

王云检 尤国华 张珉 张璐阳

肝癌术后复发转移率超过60%，成为肝癌患者死亡的主要原因[1]。侵袭与迁移是肝癌的基本特征，细胞侵袭与迁移取决于细胞黏附以及细胞外蛋白水解变性[2]。肝癌细胞可以在趋化因子刺激下发生运动，但其黏附性程度下降，容易从原发灶脱离并降解细胞外基质，形成向外转移的通道，促进肿瘤细胞的侵袭、迁移[3]。sushi重复蛋白X连锁2(sushi repeat containing protein x linked 2，SRPX2)是一种硫酸软骨素蛋白聚糖，与肿瘤的侵袭与迁移密切相关[4]。研究发现，当SRPX2的表达受到抑制，可以减缓肝癌细胞的侵袭与迁移[5]。因此，通过研究SRPX2对人肝癌细胞MHCC97H侵袭与迁移能力的影响及作用机制，为SRPX2成为肝癌治疗靶点提供一定依据。

资料和方法

一、主要试剂与仪器

人肝癌细胞MHCC97H(中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库，中国)、SRPX2特异性siRNA和阴性对照(negative control，NC)(上海吉玛生物科技有限公司，中国)。DMEM 培养基、胰酶(Gibco公司，美国)、胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)。Trizol Reagent RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，美国)、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒(大连Takara公司，中国)、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司，中国)。PCR引物序列(大连Takara公司，中国)为SRPX2引物序列：上游引物为5′-ACTGGATTTGCGGCATGTGA-3′，下游引物为：5′-CCATGTTGAAGTAGGAGCG-AGTGA-3′；MMP-2引物序列：上游引物为5′-AGACATACATCTTTGCTGGAGACA-3′，下游引物为：5′-CTTGAAGAAGTAGCTGTGACCG-3′；GAPDH引物序列：上游引物为5′-TCCCATCACC-ATCTTCCAG-3′，下游引物为：5′- GGTATCC-ATCGCCATGCTC -3′。细胞蛋白抽提试剂(碧云天生物技术研究所，中国)、鼠抗SRPX2、MMP-2(Santa Cruz公司，美国)、辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG二抗、鼠抗GADPH单克隆抗体(武汉艾美捷科技有限公司，中国)。凝胶成像仪(美国 UVP 公司)、ECL 显影液(美国 Millipore 公司) 。CO2细胞培养箱 (Thermo Revco，美国)、24孔Transwell小室(CORNING科技有限公司，美国)。NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪(Thermo公司，美国)、实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司，美国)、倒置显微镜(Nikon公司，日本)、基质胶、BIO-RAD 垂直电泳仪(BD公司，美国)、凝胶成像仪( UVP 公司，美国) 。

二、细胞培养及转染

用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养人肝癌细胞MHCC97H，条件为37℃、5% CO2，隔天换液，当人肝癌细胞HepG2处于对数生长期时进行实验。实验分为空白对照组、阴性对照组和干扰SRPX2组。空白对照组在铺板后48 h收获细胞，阴性对照组和干扰SRPX2组分别用Lipofectamine法将NC和SRPX2特异性siRNA转染到人肝细胞癌MHCC97H，继续培养48 h收获细胞，进行相关检测。

三、细胞体外侵袭和迁移能力实验

按照细胞分组分别处理24 h后对细胞进行消化，用基质胶检测侵袭能力和不铺基质胶检测迁移能力。将消化获得细胞调整浓度为5×105后接种在24孔Transwell小室中，每孔200 μl，下室加入10%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养24 h，取出小室，用无菌棉签擦拭去除上室内的细胞，用4%甲醛固定10 min，用0.1%结晶紫染液染色30 min，冲洗干净后倒置显微镜下观察细胞，拍照。计数紫色染色的穿膜细胞，即细胞侵袭和迁移能力。各剂量组设3个平行样。

四、实时荧光RT-PCR检测SRPX2和MMP-2 mRNA的表达

按照细胞分组分别处理48 h后对细胞进行消化，消化后取5 mL细胞液(细胞浓度为5×106/mL)，5000 r/min、5 min离心，根据RNA提取试剂盒操作说明书进行总 RNA提取，测定mRNA浓度和纯度，将提取的总RNA根据反转录试剂盒说明合成cDNA，根据SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ荧光定量PCR试剂盒说明，用制备20 μl反应体系，在CFX-96 PCR扩增仪中进行扩增。反应条件为预变性95℃ 30 s、 变性 95℃ 5 s、60℃ 44 s、40个循环，61 ℃时采集荧光，用实时荧光定量 PCR仪检测对其表达量进行结果分析，以GADPH作为内参，采用 2-△△Ct法计算 SRPX2和MMP-2 mRNA 的相对表达量。各剂量组设3个平行样。

五、Western Blot法检测SRPX2和MMP-2蛋白水平

按照细胞分组分别处理48 h后对细胞进行消化，消化后加2 ml无血清培养基终止消化，5 000 r/min、5 min离心，洗涤2次，加入1 μl PMSF，根据细胞量加入胞蛋白抽提液，冰浴2 h；4℃、10 000 r/min、15 min，取上清，进行蛋白定量；调整蛋白浓度，加入1/5体积的5×缓冲液，沸水进行变性，-80℃保存备用。采用 BIO-RAD 湿转系统SDS-PAGE 胶进行电泳、切胶；孵育一抗、 4℃下孵育相应条带过夜、孵育相对于二抗，于暗室内用ECL 法发光观察蛋白表达，采集图像，用凝胶成像仪对免疫印迹条带灰度值进行分析，计算目的蛋白与内参蛋白条带的灰度值比值。各剂量组设3个平行样。

六、统计学分析

结 果

一、Transwell侵袭和迁移实验检测人肝癌细胞MHCC97H侵袭和迁移能力变化

由图1～2可见阴性对照组MHCC97H侵袭和迁移能力与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，干扰SRPX2组人肝癌细胞MHCC97H侵袭和迁移能力较阴性对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 人肝癌细胞MHCC97H侵袭情况

图2 人肝癌细胞MHCC97H迁移情况

二、人肝癌细胞MHCC97H内SRPX2和MMP-2 mRNA表达的影响

由表1可见阴性对照组人肝癌细胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 mRNA相对表达量较空白对照组比较降低不显著，差异无统计学意义(P>0.05)，干扰SRPX2组人肝癌细胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 mRNA相对表达量较阴性对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 人肝癌细胞MHCC97H内SRPX2和MMP-2 mRNA表达的影响(±s)

注：*表示与空白对照组相比差异有统计学意义，P<0.05；#与阴性对照组相比差异有统计学意义，P<0.05

三、人肝癌细胞MHCC97H内SRPX2和MMP-2蛋白表达的影响

由图3可见阴性对照组人肝癌细胞MHCC97H SRPX2和MMP-2蛋白表达量较空白对照组降低不显著，差异无统计学意义(P>0.05)，干扰SRPX2组人肝癌细胞MHCC97H SRPX2和MMP-2 蛋白表达量较阴性对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

A:空白对照组、B:阴性对照组、C:干扰SRPX2组

讨 论

SRPX2最先在癌细胞中被发现，随着研究的深入，发现在正常组织中均有低表达[6]。在对结肠癌的研究中发现，SRPX2在癌症组织中高表达，且与患者的不良预后密切相关，提示SRPX2 蛋白在癌症组织中高表达[7]。SRPX2可以和组织蛋白酶B、半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等结合，影响细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的水解,而 ECM 结构的改变是影响细胞侵袭迁移的重要因素之一[7]。RNA 干扰(RNAinterference,RNAi)是基因转录后沉默的重要机制之一，通过破坏靶基因的mRNA使其基因不表达，siRNA是RNAi的效应分子。本研究发现，通过将SRPX2特异性siRNA干扰片段转入人肝癌细胞MHCC97H后，SRPX2 mRNA和蛋白的表达量都降低，同时使MMP-2 mRNA和蛋白的表达量也降低。MMP2是MMP家族的重要一员，MMP家族成员几乎都能降解ECM中的各种蛋白成分，MMP-2基因5′旁侧序列促进子区域含有2个GC盒，活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用，是ECM代谢过程中最主要的蛋白水解酶类。在裸鼠肝癌模型的研究发现，MMP-2的表达量增加可以影响肝癌细胞的轻型迁移能力，增加了肝癌细胞向裸鼠肺部转移的机会；同时，门静脉受到侵犯是肝癌发生转移的重要环节，MMP-2可以破坏狄氏间隙的网状结构，为肝癌细胞的迁移创造了条件[8]。本研究发现，通过干扰SRPX2表达，进而使MMP-2的表达降低，人肝癌细胞MHCC97H侵袭和迁移能力降低。

综上所述，SRPX2与肝癌细胞的侵袭迁移密切相关，SRPX2的表达降低，MMP2的表达也随之降低，其侵袭迁移能力也明显下降，SRPX2可能通过调节MMP2而影响人肝癌细胞MHCC97H侵袭和迁移，为肝癌靶向治疗提供一定的理论依据。