内窥镜引导气管注入博来霉素建立小鼠肺纤维化模型

余华军， 吴 尚， 黄 慧， 林碧云， 伍 俊， 欧华俊， 张海涛

(广东医科大学1. 实验动物中心， 湛江 524023；2. 生物化学与分子生物学教研室， 湛江 524023；3. 附属医院呼吸内科，湛江 524001)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的病因不明，可由环境中的有害物质、病毒感染、胃食管反流和吸烟等因素刺激，通过炎症、组织损伤、修复持续叠加造成上皮细胞损伤和成纤维细胞活化，引起细胞外基质沉积，最终发展为肺纤维化。建立稳定的肺纤维化动物模型，对抗肺纤维化药物筛选和评价极其重要。目前国际上应用最为广泛的是博来霉素诱导动物肺纤维化模型。该模型主要通过气管给药、经鼻滴注、腹腔注射或静脉给药等方法建立[1-4]，其中一次性气管内灌注的方法使用较为普遍。气管内灌注又分为直接灌注和间接灌注，两者主要是有创与无创的区别。在肺纤维化小鼠模型制备的动物选择方面，C57BL/6J 小鼠是最常用品系[5]。目前研究及应用的小鼠气管插管给药方法中，大多借助于专用仪器设备辅助插管。但普遍存在的不足是小鼠咽部结构视野范围较小及模糊，不能清晰直观进行插管操作。本研究拟采用在多功能内窥镜直视下对C57BL/6J小鼠进行气管插管，并通过此方法建立博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型，分析及评价动物模型的稳定性，为今后气管给药、肺纤维化及相关肺部疾病的研究应用奠定实验基础。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6J 小鼠15 只，18～22 g，雌雄各半，购自中山大学实验动物中心[SCXK(粤)2016-0029]。常规饲养于广东医科大学实验动物中心SPF 级设施，12/12 h 昼夜光照，温度 22～24 ℃，相对湿度 70%[SYXK(粤)2015-0147]。

1.2 主要试剂和仪器

博来霉素购自美国Sigma 公司； 羟脯胺酸(HYP)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)测试盒均购自南京建成公司；生理盐水、水合氯醛、内窥镜、冷光源放大镜和恒温加热板均购自北京鼎国公司； 病理组织切片机和石蜡包埋机均购自美国赛默飞公司。

1.3 方法

1.3.1 内窥镜直视下气管插管操作步骤 ①使用体积分数10%水合氯醛麻醉5 只小鼠，对照组和实验组各5 只； ②用丝线圈住小鼠门牙将小鼠悬挂在木板上，背部用泡沫垫高，保持头部和水平的角度在45°左右，用镊子轻轻顺向拉出舌头； ③冷光源放大镜放于动物上部，用咽拭子将咽部分泌物擦净，使用棉签下压舌部调整动物倾斜角度； ④使用已酒精消毒的内窥镜探头伸入小鼠口腔内，调整角度直至可通过内窥镜显示面板清晰看到声门，固定探头软管； ⑤手持气管导管贴门牙中间进针，沿着上颚中线插入，观察小鼠呼吸频率，在小鼠呼吸时，声门打开的瞬间插入导管，注入50 μL 印度墨汁； ⑥迅速从气道拔出套管针，抓着小鼠耳背皮肤直立旋转30 s，使药物在肺内分布均匀，侧卧位放置于恒温加热板(37 ℃)上。

1.3.2 实验处理 对照组和实验组各5 只，按上述操作步骤，分别气管给予50 μL的生理盐水和50 μL平3.5 mg/kg 的博来霉素[6]。

1.3.3 博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型鉴定 常规饲养28 d[7]，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠左肺浸于质量分数4%的多聚甲醛溶液中固定，进行石蜡包埋，病理切片，HE、Masson 染色，小鼠右肺进行HYP、MDA、GSH-PX、SOD 检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，正态分布的计量资料用x- ± s表示， 多个样本均数的比较采用单因素方差分析， 两组间比较采用t 检验， P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多功能内窥镜直视下气管插管

在多功能内窥镜显示面板上掌握小鼠的呼吸频率，在声门打开瞬间迅速插入导管，一边管口封堵30 s，小鼠此时出现躁动、口唇紫绀等缺氧症状，解除封堵后小鼠呼吸恢复、缺氧症状逐渐缓解，则表明插管成功[8]。

2.2 插管过程

按照上述的气管插管方法，使用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖暴露气管及胸腔，发现5 只注入印度墨汁的小鼠气管下端直至肺部均有黑色物质均匀分布(图1)。且各组小鼠均插管成功，插管成功率高，给药量精确，插管后无小鼠死亡情况。

2.3 博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型

由表1可见，小鼠肺组织中HYP、MDA含量，与对照组比较，实验组含量增加(P＜0.01)； 小鼠肺组织中GSH-PX、SOD 活性，与对照组比较，实验组活性降低(P＜0.01)。小鼠肺组织进行病理切片经HE、Masson 染色， 显微镜下观察(图2)， 对照组的肺组织结构清晰， 实验组肺泡间隔显著变宽， 肺泡结构破坏严重，萎缩塌陷严重，胶原纤维显著增多，出现大量炎症细胞浸润。从以上生化指标及病理学观察结果表明，应用该气管插管方法，复制博来霉素诱导小鼠肺纤维化的模型成功率较高。

3 讨论

在医学研究上， 人们通常借助于人类疾病动物模型来认识和研究各种疾病的发展及防治。建立合适的肺纤维化动物模型对临床上治疗肺纤维化疾病药物的筛选， 探讨其发病机制具有重要的作用。诱导肺纤维化常用博来霉素、二氧化硅、异硫氰酸荧光素， 通过辐射、病毒载体和转基因系统等[9，10]。应用博来霉素来诱导肺纤维化是目前最普遍的实验性肺纤维化动物模型[11-14]。博来霉素的造模给药途径有气管内滴入、雾化吸入、腹腔注射和静脉注射等方式，但各有优缺点。

图1 多功能内窥镜直视下气管插管Figure 1 Endotracheal intubation under direct vision

表1 小鼠肺组织中的生化指标Table 1 The lung indexes of mice

图2 小鼠肺纤维化的病理变化Figure 2 Pathological changes of pulmonary fibrosis in mice

Robbe等[15]使用雾化装置雾化方式吸入博来霉素，诱导大鼠肺间质纤维化。此方法避免了大鼠手术感染的风险，提高了造模成功率及肺内博来霉素分布均匀，但此方法消耗的博来霉素量大，不能定量且雾化时间过长。有研究[16]报道采用一次性大剂量和连续多次小剂量尾静脉注射博来霉素造模，此方法复制的动物模型更接近于特发性肺纤维化，但进行尾静脉注射对实验人员的技术操作要求较高。此外，腹腔内多次注射博来霉素建立的肺纤维化模型[17]，亦存在给药次数多、剂量大和造模时间长等缺点。

目前国内外最常用、最受认可的是一次性气管内灌注博来霉素诱导的动物肺纤维化模型[18]。直接灌注法是通过气管插管向气管内灌注博来霉素，间接灌注法是在动物颈部切口，找到气管后向气管内注入博来霉素。在气管给药时，研究者更多采用气管切开后滴注的方法，但这种方法对小鼠造成有创损伤，影响实验的重复性及各项生理指标。比较以上给药方式，最理想的是采用无创的方式，一次性气管内灌注博来霉素诱导肺纤维化，但这种方法操作技术要求高，需借助一些仪器设备。实验人员通常利用专门仪器设备进行辅助插管。如Brown 等[19]和Spoelstra 等[20]在专业喉镜引导下进行气管插管给药。Vergari 等[21]利用关节镜对小鼠进行气管插管，虽然成功率高，损伤小，但是需要特殊设备，成本高。本实验采用内窥镜辅助下实施小鼠气管插管，利用内窥镜探头冷光源进行调节光亮度及放大倍数，实验人员能在内窥镜的面板上更好地观察咽喉部的结构、小鼠的呼吸频率及声门的开启时间， 掌握插管的方向， 提高插管的成功率。

HYP含量能直接反映出结缔组织疾病的胶原代谢情况，通过检测组织中HYP含量， 可以判断组织纤维化程度，还可以对预防与治疗纤维化药物的筛选。而MDA 常与SOD 的检测相互配合， SOD 的活性高低间接反映机体清除氧自由基的能力， 而MDA的高低则反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。GSH-PX能特异催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和维持正常功能的作用。通过此方法建立的小鼠肺纤维化模型，实验结果显示小鼠肺组织中HYP、MDA含量， 与对照组比较， 实验组含量均增加； 小鼠肺组织中GSH-PX、SOD 活性，与对照组比较，实验组含量均降低。小鼠肺组织进行病理切片，经HE、Masson 染色，显微镜下观察实验组胶原纤维沉积严重。从以上生化指标及切片结果显示，应用该气管插管方法，复制博来霉素诱导小鼠肺纤维化的模型成功率较高，且对小鼠造成的损伤较小。

综上，在多功能内窥镜直视下的小鼠气管插管方法是一种操作便捷、成功率高、重复性好、安全性高的插管方法； 可正常通过小鼠口腔观察气管，有效地实现小鼠肺部给药， 实验人员只需经过数次练习即可熟练开展实验，具有一定的优越性和实用价值，值得推广应用。