C57BL/6J 背景基因修饰小鼠精子冷冻保种及品系恢复方法

牛博文， 陈丽香， 朱孟敏， 彭秀华， 秦波音， 李 峰

(上海市公共卫生临床中心， 上海 201508)

TALEN、CRISPR/Cas9 等基因编辑技术的出现和发展极大缩短了基因修饰小鼠的制备周期，大量的靶位点修饰、转基因小鼠被应用于基因功能的研究，这些品系小鼠的活体保种工作也成为各研究机构工作的重要部分。配子冷冻保种是将小鼠精子、卵子以及胚胎保存在极低温度下，使其新陈代谢完全停止的一种保种方式，被认为可以替代活体保种[1]。配子冷冻保存一方面可以防止品系的遗传漂变，减少各种因素造成的品系丢失，另一方面可以减少活体保种带来的人力财力消耗。常用的品系保存方法包括胚胎冷冻法和精子冷冻法。精子冷冻相比于胚胎冷冻操作更加简单，仅需要少量的雄鼠即可完成，同时在复苏后可以在短时间内繁育出大量后代。对于大多数品系小鼠而言最常用的冷冻液由18%棉子糖和3%脱脂奶粉组成，但是对于C57BL/6J 等品系小鼠，该冷冻液复苏后受精率在10%以下[2，3]， 而大多数基因修饰鼠以C57BL/6J为背景鼠，所以改善该品系的精子冷冻和复苏效率尤为重要， 本文主要围绕精子冷冻液、精子复苏方法和冷冻精子体外受精(IVF)等方面进行探索及优化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3～6 月龄C57BL/6J 雄鼠、4 周龄C57BL/6J 雌鼠、8 周龄ICR 雌鼠均为SPF 级， 购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2013-0016]； 基因修饰小鼠为上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心实验动物部 [SCXK(沪)2015-0002]保种品系， 均饲养于上海市公共卫生临床中心实验动物部[SYXK(沪)2015-0008]SPF 动物设施内，饲喂以高压灭菌水和60Co 辐照饲料，饲养室相对湿度(50±10)%，温度(23±3)℃， 光照12 h 明暗交替。

1.2 主要试剂仪器

M2 培养液(MR-015P-D)、KSOM 培养液(MR-020P-5F)、HTF 培养液(MR-070-D)、棉子糖(R0250)、MTG(56454)、GSH(G4251)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，P8136)均购自德国Merck 公司； 脱脂奶粉(A600669)、D-PBS 均购自生工生物工程(上海)股份有限公司； 孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)均购自宁波第二激素厂， 0.25 mL 细管(005565， 法国卡苏公司)，培养皿(美国Corning 公司)，体式显微镜(SZ61，日本Olympus 公司)，显微手术镊(苏州施强医疗器械公司)，水浴锅(上海精宏实验设备公司)。

1.3 主要溶液配制方法

1.3.1 冷冻保护液配制 R18S3 冷冻液： 将9 g 棉子糖加至30 mL 去离子水中， 80 ℃水浴锅中加热30 s使其完全溶解， 再加入1.5 g脱脂奶粉， 定容至50 mL，室温15 000×g 离心20 min，弃沉淀，重复两次直至上清液透明，0.22 μm 过滤器过滤。M-R18S3冷冻液： 每50 mL R18S3 冷冻液中加入2 μL MTG，0.22 μm 过滤器过滤，分装，-20 ℃保存[11]。

1.3.2 GSH配制 准确称取GSH 30.4 mg，用1 mL无菌超纯水， 0.22 μm 过滤器过滤， 分装，-20 ℃保存，此溶液浓度为100 mmol/L，使用前每100 μL HTF 培养液中加入1 μL 进行稀释。

1.4 实验方法

1.4.1 冷冻装置 冷冻装置为高约20 cm 的泡沫保温盒，液氮高度为10 cm，将厚度约为0.5 cm 的泡沫板漂浮在液氮表面，在冷冻前30 min 泡沫盒中加入液氮预冷泡沫漂浮板。

1.4.2 冷冻方法 ①低浓度精子冷冻法：无菌取出3～6 月龄雄鼠附睾尾及1.5 cm输精管，在D-PBS中用显微镊剥离脂肪和血管，清洗干净后放入含有1 mL 冷冻液的培养皿中，用1 mL 注射器针头将附睾尾划破，挤压出附睾尾及输精管中的精子， 37 ℃温箱中放置10 min。培养结束后，取1 μL 精子于D-PBS 中稀释10 倍，观察精子运动状况， 选择运动状况良好的精子， 按照图1 所示装入0.25 mm冷冻细管中， PVA 封口结束后立即放入预冷的液氮漂浮板上预冷10 min，之后投入液氮中长期保存。②高浓度精子冷冻法： 采集和冷冻方法同低浓度组，用120 μL 冷冻液悬浮撕开的附睾尾及输精管，每支细管装入10 μL(0.5 cm)冷冻精子。

图1 0.25 mm 冷冻细管填装冷冻精子示意图

1.4.3 冷冻精子复苏 在雌鼠注射hCG后12 h开始复苏精子。将细管从液氮中拿出，在空气中停留5 s，立即投入37 ℃水浴锅中，1 min 后取出，擦干细管表面水分，剪掉两端冷冻液，将精子吹入空的培养皿中。①低浓度精子冷冻组，用枪头将10 μL 复苏的精子(约106个)吹入含200 μL HTF 培养液的受精皿中，37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中孵育1 h； ②高浓度精子冷冻组，用10 μL 枪头将复苏的精子(约107个)吹入含80 μL HTF 的获能皿中，37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中放置30 min 后用枪头在获能滴的边缘吸入10 μL 活动精子并转移至含200 μL HTF 的受精皿中，培养箱中孵育30 min。

1.4.4 体外受精(IVF) 小鼠超数排卵： 4周龄C57BL/6J 雌鼠按每只5 IU 腹腔注射PMSG，47 h 后按每只5 IU 腹腔注射hCG； 在精子复苏后30 min开始收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)。无菌取出超数排卵的雌鼠输卵管，在体式显微镜下用1 mL 注射器针头撕开输卵管壶腹部，轻轻挤压出COCs， 在HTF培养液中清洗3 遍； 用200 μL 枪头将COCs 转移至含有精子的受精液中。4～6 h 后用枪头吹散粘附在卵母细胞表面的精子， 转入M2培养液中清洗5遍后将胚胎转移至过夜平衡的KSOM 培养液中培养。

1.4.5 胚胎移植 取0.5 d假孕ICR受体鼠， 麻醉， 剔除背部毛发，酒精及碘酊消毒，剪开脊柱背侧皮肤，剪开脊柱两侧0.5 cm 处肌肉层，在此创口处用钝头镊子夹住脂肪垫拉出附带的卵巢及输卵管，用脂肪夹固定，在体视显微镜下找出输卵管壶腹部，用1 mL 注射器针头在壶腹部前侧刺一切口，之后将移卵针中的卵裂胚胎经此切口吹入输卵管壶腹部(可用气泡作为标记)，再将输卵管及卵巢放回腹腔，分别缝合肌肉层及皮肤，碘酊消毒。

2 结果

2.1 不同组合精子冷冻液及IVF液的冷冻复苏效率

以低浓度精子冷冻法进行精子冷冻，复苏后与C57BL/6J 品系雌鼠卵子孵育进行IVF，对比表1中几种不同组合的精子冷冻液和IVF液的胚胎发育情况(表1)，用R18S3 或M-R18S3 进行精子冷冻，复苏后以HTF培养液进行IVF，2-细胞发育率分别为8.4%及20.6%，而复苏后采用浓度1 mmol/L GSH 的HTF 液进行IVF，2-细胞发育率可分别达到25%及43.5%，若用M-R18S3 进行精子冷冻，复苏后用浓度为1.5 mmol/L GSH 的HTF 培养液进行IVF，2- 细胞发育率降至21.4%。

2.2 两种不同精子密度的冷冻和复苏方法比较

M-R18S3 作为冷冻保护液，分别用高、低浓度精子冷冻及复苏法进行IVF，高浓度精子冷冻组相比于低浓度精子冷冻组，2-细胞发育率由41.3%(31/75)提高至64.2%(36/64)。

表1 不同组合冷冻液及IVF 液胚胎发育情况

2.3 不同类型基因修饰小鼠的冷冻效果

用高密度精子冷冻法对本中心保种的四种C57BL/6J 背景的基因修饰小鼠进行精子冷冻、复苏及IVF，结果(表2)显示，冷冻精子IVF 后2-细胞发育率34%～90%，将部分2-细胞移植入假孕受体鼠输卵管中，4 种小鼠均有子代出生，出生率40%～57%。

表2 几种基因修饰小鼠冷冻精子IVF 后胚胎发育及出生情况

3 讨论

随着基因修饰方法的不断改进和发展，基因修饰动物已经成为科学研究中常用的实验材料，传统的保种方式大多采用活体保种，这种方式往往会出现遗传变异，同时对动物设施要求较高。低温冷冻保存方式可以克服这些缺点，与胚胎冷冻相比，精子冷冻技术具有方便、快速、成本及设备要求低等特点，正被广泛应用。

精子冷冻即将精子保存在极低温度下(-196 ℃)，完全抑制精子的新陈代谢，精子复苏后能够恢复受精能力。在这一过程中，由于渗透压、温度等的变化，精子细胞会受到一系列的损伤，导致精子死亡或者失去受精能力[4]，所以相比于新鲜精子，冷冻精子的受精率往往较低。目前，小鼠精子冷冻方法较多，包括冷冻液、冷冻容器、冷冻装置以及精子处理方法等方面均有相关的研究[5，6]。本实验室通过试验对比多种冷冻装置及容器，我们认为泡沫漂浮板及0.25 mm冷冻细管进行精子冷冻操作更加简便，冷冻效果较为稳定，且对于非专业技术人员较容易掌握。

小鼠精子冷冻常用的冷冻液是R18S3，但是由于不同品系对于冷冻损伤的敏感性不同[3]，NOD、FVB、DBA 及杂交小鼠冷冻精子复苏后2-细胞发育率可以达到35%～70%，C57BL/6J、BALB/c、129S3/SvIm 等品系小鼠冷冻精子复苏后2-细胞发育率仅为6%左右[2]，本实验中C57BL/6J品系小鼠冷冻精子复苏后2-细胞发育率为8.4%。实验证明，在R18S3冷冻液基础上加入抗氧化剂例如GSH、谷氨酰胺、褪黑激素、橡黄素、红景天多糖等可以提高精子冷冻复苏效率，这是由于在冷冻降温和复苏后，精子呼吸代谢会产生大量的活性氧(ROS)，ROS 能够氧化精子质膜，损伤精子功能，而抗氧化剂可以清除这些ROS[7-9]。参考相关研究[2，10，11]，本研究在R18S3 冷冻液中加入终浓度为477 μmol/L 的MTG，2-细胞发育率由8.4%升高至20.6%，这可能与MTG 的抗氧化作用有关。冷冻精子在复苏后运动能力下降50%左右，这类精子细胞往往缺乏受精能力[12]，为了避免这些精子产生ROS 影响受精率，往往需要将复苏后的精子进行洗涤处理。在家畜精子复苏中通常采用浮游法和密度梯度离心法进行洗涤，但是密度梯度离心法需要离心处理，可能对精子造成二次损伤[13]，本研究参考浮游法筛选获得活力较高的精子。此外，为保证IVF时有足够的精子量，本研究也采用高浓度精子冷冻法[10]，精子复苏后在受精滴中用IVF液将高浓度精子稀释至合适的浓度，孵育一定时间后活力较强的精子将浮游至液滴边缘，用此类精子进行IVF，C57BL/6J 小鼠的受精率可由41.3%提高至64.2%。GSH 是人体内一种重要的内源性抗氧化物，是存在于精子和精浆内的 ROS 清除剂之一，在保护精子对抗氧化损伤的防御机制中起着重要作用[14]。本研究在IVF 液中加入1 mmol/L GSH，可使受精率显著提高，达到43.5%。有观点认为适当水平的ROS 在精子的高活跃性运动、获能、顶体反应中具有重要作用[14]，本研究在受精液中加入1.5 mmol/L GSH 时，受精率下降至21.4%，这可能与GSH 消除较多的ROS 导致精子获能及顶体反应受到影响有关。

根据Jackson实验室统计，目前以C57BL/6J 为背景的基因修饰小鼠约占75%[2]，为验证本研究建立的方法是否适合这些基因修饰小鼠的保种工作，我们选取本中心几种C57BL/6J背景的基因修饰小鼠进行精子冷冻。冷冻精子IVF 后2-细胞平均发育率可以达到50%，且移植后均有子代出生。这说明本研究中所用方法可以作为C57BL/6J背景基因修饰小鼠的保种方法。

综上所述，以M-R18S3 作为冷冻保护液，采用高浓度精子细管冷冻法进行精子冷冻，冷冻精子复苏后通过受精滴浮游法进行筛选， 在含1 mmol/L GSH 的HTF 培养液中进行IVF，这一技术体系可以作为C57BL/6J 背景基因修饰鼠的保种方法，为常规实验室进行精子冷冻提供了较理想的方法。