树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养

王文广， 匡德宣， 陆彩霞， 罕园园， 李 娜， 仝品芬， 孙晓梅， 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室、云南省眼科疾病防治研究重点实验室、中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队， 昆明 650118)

树鼩是一种新开发的极具潜力的实验动物资源，与灵长类动物的进化关系比啮齿类动物更接近，其免疫系统、神经系统中关键调节因子和信号通路与非人灵长类动物及人类有很高的同源性、保守性，并有其独特的特征[1]，因此越来越受到科研人员的重视。人们先后利用树鼩在病毒感染、肿瘤、内分泌、神经和视觉等方面进行了深入的研究，也成功建立了多种病毒感染树鼩的动物模型，树鼩有望在许多方面作为非人灵长类的替代动物而被广泛应用于生命科学研究[2]。

同时，基于树鼩细胞水平的体外研究也逐渐发展，目前文献报道的包括树鼩的原代肝细胞[3]、肝枯否细胞[4]、海马神经干细胞[5]、脑星形胶质细胞[6]、淋巴细胞[7]、角膜上皮细胞[8]和骨髓间充质干细胞[9]等成功分离培养和应用，一方面可在尽量减少个体差异干扰的情况下对体内模型起到补充验证作用，另一方面也为各种疾病相关机制的探讨和药物的筛选提供了很好的体外实验平台。

本研究尝试建立一套树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养方法，以期为因环境问题而日渐高发的各种肺病或其他感染性疾病研究提供新的实验材料。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

经人工繁育幼龄树鼩，来自中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心[SCXK(滇)K2018-0002]，饲养于普通环境[SYXK(滇) K2018-0002]。对照用人胚肺二倍体成纤维细胞(KMB-17)，来自中国医学科学院医学生物学研究所。

1.2 主要仪器及试剂

倒置荧光相差显微成像系统(ECLIPSE)购自日本尼康公司，CO2培养箱购自美国Thermo 公司，PowerWave XS2微孔板分光光度计购自美国BioTek公司，DMEM培养基和胰蛋白酶购自美国HyClone公司，胎牛血清购自以色列BI 公司，MTS 一步法细胞活力检测试剂盒购自美国Pr omeg a 公司，Vimentin 波形蛋白抗体购自德国Merck Millipore 公司，DMSO 购自美国Solarbio 公司，一步法细胞冻存液Ori CellTMNCR Protein-Free Cryopreservation Medium 购自美国Cyagen 公司。

1.3 方法

1.3.1 树鼩肺组织取材 选取新生2 d左右被母树鼩弃养的幼树鼩，注射1 mL 质量分数为1%戊巴比妥钠过量麻醉处死； 先以体积分数75%酒精浸泡消毒，再用含体积分数1%双抗的PBS 冲洗一次，剪开胸腔，取出肺组织，剔除胸膜以及气管、支气管和血管较为集中的肺组织，PBS 冲洗3 次后剪成1 mm3组织小块备用。

1.3.2 组织块贴壁法培养树鼩肺成纤维细胞 用一次性巴氏吸管将1.3.1 中肺部组织小块转入25 cm2细胞培养瓶中，均匀分布，静置2～3 min 后轻轻翻转培养瓶，加入3 mL 含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养液，于CO2培养箱中37 ℃倒置培养1～2 h，待组织块贴牢后轻轻翻转培养瓶正置培养。培养期间根据生长情况更换培养液，使用倒置显微镜观察拍照。

1.3.3 酶消化法培养树鼩肺成纤维细胞 取1.2.1中所得肺组织小块，按约1∶5 的体积比例加入质量分数0.1%胰酶， 37 ℃下振荡消化约20 min， 至大部分组织块消化为细胞悬液； 加入等体积的DMEM完全培养液(含体积分数10%胎牛血清)，终止消化；1 200 r/min 离心5 min，弃上清； 加入4 mL DMEM完全培养液重悬， 转入25 cm2培养瓶中， 于CO2培养箱中37 ℃培养过夜； 第二日倒去培养液并用PBS洗去组织小块和未贴壁细胞， 加完全培养基继续培养。

1.3.4 树鼩肺成纤维细胞的传代培养 对原代培养的树鼩肺细胞进行定期观察，当细胞铺满瓶底80%左右面积即可进行首次传代，经PBS 润洗后，加质量分数0.25%胰酶消化，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM 完全培养液终止，并按照1∶2 进行传代培养，定期观察拍照。采用差速贴壁法进行纯化，即消化传代的细胞37 ℃贴壁培养3 h 左右，倒掉培养液并用PBS 润洗以除去未贴壁细胞，然后补足完全培养液继续培养。

1.3.5 树鼩肺成纤维细胞的免疫荧光鉴定 消化第二代树鼩肺细胞接种至12 孔板，培养2 d 待其大部分长成细胞单层，PBS 清洗2 次， 使用质量分数4%的多聚甲醛溶液固定20 min； PBS 清洗3 次， 用质量分数0.5%的Triton-X100 穿孔15 min； PBS 漂洗3 次， 山羊血清封闭液封闭30 min； PBS 漂洗3次，加入经质量分数3%的BSA 稀释的小鼠源Vimentin一抗(1∶500)进行孵育，4 ℃过夜； PBS 漂洗3 次，加入经质量分数1%的BSA 稀释的荧光标记的兔抗鼠IgG 二抗(1∶500)，37 ℃避光孵育1 h； 暗光环境中，PBS 漂洗3 次，滴加DAPI 避光孵育2 min，对标本进行染核； PBS 漂洗3次，洗去多余的DAPI；在荧光显微镜下进行观察。

1.3.6 树鼩肺成纤维细胞的冻存和复苏 选取状态良好的第三代树鼩肺成纤维细胞，分别采用DMSO 和一步法细胞冻存液NCR Protein-Free Cryopreservation Medium 进行细胞的冻存。分别复苏细胞，通过形态观察和细胞生长曲线的绘制来评价细胞复苏后的活力。

DMSO冻存法： 取约90%长满瓶底的树鼩肺成纤维细胞，质量分数0.25%胰蛋白酶消化，用完全培养液吹打制成细胞悬液，移至15 mL 离心管中； 1 200 r/min 离心5 min，吸弃上清； 加入含体积分数10%DMSO的细胞冻存液重悬细胞，转入细胞冻存管中，细胞密度控制在105/mL～106/mL； 将封好的冻存管于4 ℃放置15 min，然后转入-20 ℃放置30 min，再转入-80 ℃过夜，之后放入液氮长期保存。

一步法细胞冻存： 前期操作同DMSO法， 消化细胞， 制成细胞悬液， 移至15 mL离心管中； 1 200 r/min离心5 min，吸弃上清； 加入一步法细胞冻存液NCR Protein-Free Cryopreservation Medium， 重悬细胞， 转入细胞冻存管中，细胞密度控制在105/mL～106/mL；将封好的冻存管直接转入-80 ℃冰箱，24 h 后转入液氮长期保存。

细胞复苏： 将细胞冻存管从液氮中取出后，立即放入37℃左右的温水中，不断晃动，使其迅速完全融化； 用体积分数75%乙醇消毒冻存管表面后移至超净工作台，用加样枪将细胞悬液转至15 mL离心管中，1 200 r/min 离心5 min，弃上清； 用适量DMEM 完全培养液重悬细胞，转入细胞培养瓶内，于CO2培养箱中37 ℃培养观察； 另留取适量复苏细胞重悬液台盼蓝染色，通过细胞计数，计算细胞的存活率。

1.3.7 细胞生长曲线 选择连续传代培养的和经两种方式冻存复苏处理的第4代树鼩肺成纤维细胞为对象，以KMB17 为对照，按MTS 法连续7 d 测定细胞活力，绘制细胞的生长曲线。贴壁完全树鼩肺成纤维细胞，以质量分数0.25%胰酶消化后制备密度为5×104/mL 的细胞悬液，按每孔200 μL接入96 孔板，体积分数5% CO2培养箱中37 ℃连续培养7 d，每2 d 换液1 次； 每隔24 h，对照组、空白组和实验组各取3 个复孔，每100 μL 培养液加入20 μL CellTiter 96®A Queous One Solution Reagent，孵育2 h 后，分光光度计读取490 nm 波长下的吸光度(A)值； 连续测定7 d 后，根据培养时间和对应的吸光度值绘制各细胞的生长曲线。

2 结果

2.1 树鼩肺细胞的原代培养

组织块贴壁法培养树鼩原代肺细胞，2 d 左右可见细胞从肺组织块周边迁出，随后不断扩大范围，一般培养7 d 左右新生细胞可以铺满培养瓶底约80%的面积，培养6 d 的细胞形态见图1A，多数成纤维状； 胰酶消化法培养周期相对较短，2 d左右可见基本长满瓶底，细胞形态多呈现为梭形(图1B)； 两种方法均可培养出树鼩原代肺细胞， 并且多数细胞均呈梭形，与KMB-17(图1C)大致相似。

2.2 树鼩肺细胞传代培养

树鼩肺细胞经过原代培养形成细胞单层后，即可进行传代，通过差速贴壁法进行纯化，培养2 d 可见形成的细胞单层普遍表现出纤维状形态，连续进行4 次传代，在倒置显微镜下观察细胞状态基本能够保持一致(图2)，但成纤维细胞的纯度尚需进一步的鉴定。

图1 树鼩原代肺细胞培养形态Figure 1 Culture morphology of primary pulmonary cells of tree shrew

图2 树鼩肺细胞传代培养形态 (2 d)Figure 2 Subculture morphology of tree shrew pulmonary cells (2 d)

2.3 树鼩肺成纤维细胞的鉴定

使用波形蛋白抗体Vimentin对培养的第3代树鼩肺细胞进行免疫荧光鉴定，以KMB-17细胞为对照，如图3 所示，可见树鼩肺细胞波形蛋白普遍呈现绿色荧光，证明所培养细胞为成纤维细胞，纯度比例高达95%以上。

2.4 树鼩肺成纤维细胞的冻存与复苏

树鼩肺成纤维细胞的冻存分别采用了传统的DMSO 法和一步法细胞冻存液NCR Protein-Free Cryopreservation Medium进行， 分别对复苏细胞计数，计算出DMSO法冻存复苏后细胞存活率77.5%，一步法试剂冻存复苏后细胞的存活率为82%。细胞复苏后24 h 的形态见图4，可以看出两种方法冻存的细胞均能顺利恢复，并保持均一的成纤维细胞形态，而具体的细胞活力则通过细胞生长曲线的绘制来评价。

2.5 细胞生长曲线

MTS 法连续7 d 测定细胞活力，根据490 nm波长下的吸光度值绘制出细胞生长曲线如图5所示，可以看出各细胞生长状态大致呈现出经典的S 型，先经过1～2 d 恢复期，在3～4 d 开始迅速增殖，基本从第5 日开始维持在一个平台期，与正常连续传代的细胞相比，复苏后的树鼩肺成纤维细胞仍保持着良好的细胞活力，DMSO和一步法冻存液的冻存复苏效果基本一致。

3 讨论

肺脏是呼吸系统的主要器官，大多数呼吸系统疾病的发展都与肺部密切相关，树鼩也曾先后被应用于各种人类呼吸系统疾病的研究。肺癌是目前死亡率最高的恶性肿瘤之一，陈小波等[10]应用宣威烟煤粉尘PM10 对树鼩行气管内灌注，研究表明宣威烟煤粉尘可以导致树鼩支气管上皮出现支气管粘膜上皮过度增生-鳞状化生-不典型增生-早期侵润癌的病理变化，有望利用树鼩建立宣威烟煤粉尘致肺癌模型。甲型H1N1 流感曾在全球范围内大规模流行，研究[11]表明人的H1N1 流感病毒可在树鼩的上呼吸道复制，使其表现出轻微或中度的呼吸道症状及呼吸道的病理变化，广泛分布于气管和鼻黏膜的受体是sialic acid (SA)a2，6-gal，而肺组织中的主要受体是(SA)a2，3-gal。

图3 树鼩第3 代肺成纤维细胞的免疫荧光鉴定Figure 3 Immunofluorescence identification of the third generation pulmonary fibroblasts of tree shrew

图4 复苏后的树鼩肺成纤维细胞形态(24 h)Figure 4 Morphology of tree shrew pulmonary fibroblasts after recover (24 h)

图5 树鼩肺成纤维细胞生长曲线Figure 5 Growth curve of tree shrew pulmonary fibroblasts

树鼩肺部细胞的分离培养及体外感染模型的建立，对相关疾病的发病机制研究或药物筛选具有重要应用价值。成纤维细胞是肺组织中重要的间质细胞，主要功能是参与肺脏的组织构架、合成和分泌胞外基质以及修复损伤组织等[12]。肺成纤维细胞是体外研究慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等肺部相关疾病的重要实验材料，其常见的分离培养方法有组织块贴壁法[13]和酶消化法[14]。本研究采用上述两种主流方法对树鼩肺成纤维细胞进行分离培养，鉴于肺组织中有大量的血管和毛细血管、气管和支气管以及肺泡等，这些材料均会影响成纤维细胞的培养纯度，因此在进行组织取材时，优先剪取各叶肺边缘区域组织，尽量避开核心区域比较密集的血管和气管。组织块贴壁法培养2 d 后可观察到细胞从组织块周边迁出，7 d 左右细胞可大体铺满培养瓶底，胰酶消化法则在3 d 左右即可观察到细胞基本铺满瓶底，两者均以成纤维状细胞为主，与人胚肺二倍体成纤维细胞KMB-17 相似。培养过程中，不同细胞的贴壁时间不一样，成纤维细胞贴壁最快，而且经胰酶消化时也较易脱落，因此，可利用差速贴壁法对肺成纤维细胞进行纯化。传代时消化时间不要过久，2 min 左右为宜，及时终止消化并吹打细胞，对胰酶不太敏感的细胞则滞留在培养瓶底； 细胞贴壁培养2 h 左右，进行换液，除去贴壁慢的其他细胞，如此进行2 ～3 次重复即可实现纯化。

成纤维细胞特异表达波形蛋白，本研究使用小鼠源的波形蛋白抗体Vimentin对培养的第3代树鼩肺细胞进行免疫荧光鉴定，同样以KMB-17为对照，树鼩肺成纤维细胞普遍呈现绿色荧光，其纯度在95%以上，证明实验中所采用的树鼩肺成纤维细胞分离培养和纯化方法是可行的。

树鼩肺成纤维细胞使用含10% 胎牛血清的DMEM 培养液， 可连续进行传代4～5 次，第4～5 代细胞保持均一形态，生长旺盛，可用来开展相关实验。传至第6 代以后，细胞形态开始变化，有不规则的空泡状细胞出现，而且生长速度变慢，长满单层时间延长，不能继续传代，因此，需要及时对状态良好的树鼩肺成纤维细胞进行冻存。本研究选取第3 代树鼩肺成纤维细胞，分别采用传统的DMSO和一步法冻存试剂进行了细胞的冻存与复苏实验，通过形态观察和生长曲线绘制进行活力评价，表明两种方法均可有效冻存细胞，细胞复苏后可仍保持良好的活力，其中一步法冻存试剂操作便捷，省时省力，可有效减少人为操作的误差，比较适合树鼩肺成纤维细胞的冻存。