分子印迹电化学传感器检测链霉素

何雪丽，李云倩，宋雨莹，吕晓芳，张蒙，廉文静

（天津农学院 基础科学学院，天津 300384）

链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阴性细菌具有杀灭作用[1-2]。近年来，链霉素作为抗菌药物被广泛应用于农业及畜牧业中[3]。长期摄入含有超量链霉素的食品对人体有严重的副作用，如:过敏反应、肾毒性、耳毒性等[4]。因此，探索快速、灵敏检测链霉素的方法具有非常重要的研究意义和应用价值。

电化学分析方法具有检测灵敏度高、简单快速、成本低等优点，因而被广泛应用于各类物质的分析检测中。分子印迹技术模拟自然界中天然分子识别系统的特异性识别作用，具有特异性强、稳定性高等优点[5]。近年来，将分子印迹技术与电化学分析方法结合构建分子印迹电化学传感器已成为一种非常有前景的分析方法[6]。

本研究结合分子印迹技术与电化学检测方法的优点，以链霉素为模板分子，吡咯为功能单体，利用简单电聚合方法制备特异识别链霉素的分子印迹聚合物（MIP） 膜，构建链霉素分子印迹电化学传感器。通过对传感器测定条件优化选择，实现链霉素的快速、灵敏检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:CHI660E型电化学工作站；三电极系统（铂丝对电极，饱和甘汞参比电极，金工作电极）；BSA223S型电子天平；KH5200B型超声波清洗仪；HWCL-3型恒温磁力搅拌器。

试剂:硫酸链霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素、红霉素、吡咯（购于阿拉丁试剂有限公司）；氯化钠、氢氧化钠（购于天津市风船化学试剂有限公司）；铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（购于北京化工厂），以上试剂均为分析纯。抛光氧化铝粉（购于天津艾达恒晟科技有限公司），牛奶样品购于本地市场，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 金电极预处理

将金电极依次用1 μm、0.3 μm和50 nm粒径的氧化铝粉抛光处理，然后将处理后的金电极置于蒸馏水中超声震荡30 s，得到表面光洁的金电极。

1.3 链霉素分子印迹传感器的制备

将三电极系统置于含有10 mmol/L链霉素和30 mmol/L吡咯的pH 6.8的磷酸缓冲液中，利用循环伏安（CV）法在金电极表面电聚合得到MIP膜（扫速0.05 V/s，聚合电位为0～1.4 V，聚合圈数为5圈）。将电聚合后的MIP薄膜电极室温晾干后，置于0.1 mol/L氢氧化钠洗脱液中磁力搅拌15 min除去模板分子链霉素，得到对链霉素具有特异识别作用的洗脱后的MIP薄膜电极。

1.4 电化学检测

采用三电极系统利用CV法在含有5 mmol/L铁氰化钾和0.5 mol/L氯化钾的水溶液中进行电化学检测（扫速0.05 V/s，扫描电位为0.2～0.6 V，扫描圈数为3圈，选择第3圈稳定数据作为测定结果）。所有电化学检测实验均在室温条件进行。

1.5 实际样品制备

实际牛奶样品从当地市场购得，按照牛奶样品与蒸馏水体积比为1∶4的比例对牛奶样品进行稀释，然后利用无菌微孔过滤膜（0.22 μm） 将稀释后的牛奶样品过滤。

2 结果与讨论

2.1 传感器构建过程的循环伏安表征

以铁氰化钾为探针，采用三电极系统利用CV法在含有5 mmol/L铁氰化钾和0.5 mol/L氯化钾的水溶液中对传感器构建过程进行表征。测定结果如图1所示。裸金电极的CV曲线有一对可逆的氧化还原峰（曲线a）。当在金电极表面电聚合一层MIP膜后，电极的氧化还原峰电流明显降低（曲线b），这是因为电聚合后在金电极表面形成的紧密MIP膜阻碍了铁氰化钾探针在电极表面的电化学反应。当利用洗脱剂洗脱掉模板分子链霉素后，电极的电流响应明显增强（曲线c），这是由于洗脱后，MIP膜表面很有很多链霉素的识别位点，MIP膜变成多孔结构，有助于铁氰化钾探针穿过孔穴到达电极表面，发生电化学反应。将洗脱后的电极置于1.00×10-5mol/L链霉素溶液中进行重结合，发现重结合后，电极的电流响应明显降低（曲线d），这是因为重结合后，MIP膜上链霉素的特异性识别位点重新被占据，MIP膜上的立体孔穴数量明显变少，阻碍了铁氰化钾的电化学反应。CV表征表明:构建的链霉素分子印迹电化学传感器对链霉素具有识别作用，可以利用洗脱及重结合后电极的氧化峰电流差值ΔIpa与链霉素浓度c之间的关系对被测链霉素进行定量分析。

2.2 测定条件优化

在分子印迹电化学传感器构建过程中，模板分子与功能单体的比例、电聚合圈数、洗脱时间及重结合时间对传感器的稳定性和分析性能有很大的影响。因此，本研究利用CV表征对传感器的构建及测定条件进行了优化选择，经优化发现:模板分子与功能单体的摩尔比为1∶3，电聚合圈数为5圈，洗脱时间和重结合时间均为15 min时，传感器的电流响应最大，稳定性和检测灵敏度最强。

图1 传感器构建过程循环伏安图，

2.3 校准曲线的绘制

在最优化条件下，用该传感器测定5.00×10-9～1.00×10-3mol/L浓度的链霉素，先测定铁氰化钾探针溶液在洗脱后电极上的CV氧化峰电流Ipa1，然后将洗脱后的电极浸入到不同浓度链霉素溶液中重结合15 min，测定铁氰化钾在重结合后电极上的的CV氧化峰电流Ipa2。

根据链霉素浓度c与洗脱及重结合后电极的氧化峰电流差值ΔIpa（ΔIpa=Ipa1-Ipa2）的关系绘制传感器的校准曲线，如图2所示。传感器的线性范围为 5.00×10-8～8.00×10-5mol/L，线性方程为ΔIpa(A)=6.062 (A)+0.056394c(mol/L)(r=0.996)，LOD 为 3.45×10-8mol/L(S/N=3)。

图2 传感器检测链霉素的校准曲线

2.4 传感器的选择性、重复性及稳定性研究

选择性研究:为了研究该传感器对链霉素的特异选择性，选择链霉素的三种结构类似物（新霉素，庆大霉素，红霉素）作为干扰物质，利用传感器对1.00×10-5mol/L链霉素及1.00×10-4mol/L新霉素，1.00×10-4mol/L庆大霉素和1.00×10-4mol/L红霉素进行测定。CV测定结果如图3所示。传感器对链霉素的电流响应远大于对三种干扰物质的电流响应，说明该传感器对链霉素具有很强的特异选择性。

图3 传感器的选择性

重复性研究:利用相同的方法构建5个链霉素分子印迹电化学传感器，并对5.00×10-6mol/L链霉素进行测定，5次测定的相对标准偏差（RSD）为3.9%，说明该传感器具有良好的重复性。

稳定性研究:利用相同的方法构建3个链霉素分子印迹电化学传感器，并对5.00×10-6mol/L链霉素进行测定并记录测定的氧化峰电流值。然后将3个传感器室温放置10天后再对5.00×10-6mol/L链霉素进行测定，发现测定的氧化峰电流值约为初次测定的93%，说明该传感器具有良好的储存稳定性，放置一段时间后，仍然可以用于链霉素的测定。

2.5 实际样品检测

为了研究该传感器的实际应用性，利用该传感器对市售牛奶样品进行测定，未检出链霉素，说明牛奶样品中不含链霉素或该传感器灵敏度不够高，牛奶样品中链霉素含量低于传感器的LOD。因此，采用加标测定法，在牛奶样品中加入 3种浓度 （1.00×10-6mol/L,5.00×10-6mol/L,1.00×10-5mol/L） 的链霉素后，利用该传感器对加标后的牛奶样品进行测定，测定结果如表1所示，回收率为95%～106%，平行样品测定的RSD为4.3%～5.2% (n=3)，说明该传感器适用于实际样品中链霉素的定量测定。

3 结论

本研究分别以链霉素、吡咯为模板分子、功能单体为样本，利用简单电化学聚合方法制备得到对链霉素具有特异识别作用的MIP膜。通过对传感器测定条件优化选择，得到该传感器在5.00×10-8～8.00×10-5mol/L 范围内对链霉素呈良好线性，LOD为3.45×10-8mol/L。该传感器具有良好的选择性、重复性和再现性，并在实际样品测定中得到了很好的回收率。该研究为食品中链霉素的快速、灵敏分析提供了简单、高效的方法。

表1 牛奶样品加标检测链霉素