HPLC法测定人血浆中伏立康唑及其代谢物的浓度

王志君，杨云云，张文静，王学彬，宋洪杰，王 卓

(海军军医大学附属长海医院药学部，上海 200433)

伏立康唑(voriconazole)为三唑类广谱抗真菌药，2004年被FDA批准为曲霉菌或念珠菌血症的首选药物。其抑制麦角甾醇的合成，导致细胞膜的通透性异常，促使真菌细胞死亡，从而发挥强大的抗真菌效应[1]。与其他三唑类抗真菌药相比，伏立康唑是一种耐受性良好的药物，但有肝毒性、神经毒性，同时伏立康唑的药动学个体间差异很大，主要原因是人体内的代谢酶CYP2C19具有遗传多态性，特别是亚洲人中弱代谢者的发生率高达15%～20%，同时患者自身的疾病状态或合并用药可能增加伏立康唑代谢的差异[2-7]。因此，对伏立康唑及其主要代谢物伏立康唑氮氧化物进行血药浓度监测具有临床意义。目前，用于伏立康唑血药浓度测定的方法主要包括微生物检测法、高效毛细管电泳(HPCE)法、高效液相色谱-荧光检测法和超高效液相色谱串联质谱法[8-11]，考虑到临床应用的实用性和可行性，本研究建立了样品沉淀蛋白，并用HPLC-UV测定的方法，使其具有快速、灵敏、准确、稳定的特点，并可以同时测定伏立康唑及其氮氧化物，以便用于日常治疗药物监测(TDM)和个体化给药调整。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪(包括SPD-20A紫外检测器、SIL-20AC自动进样器、CTO-20A柱温箱日本岛津公司)；C18-AR色谱柱(ACE 150 mm×4.6 mm，柱号：V12-6682)；XW-80A涡旋混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；离心机(Eppendorf AG 22331 Hamburg 5452ZR858343)；SQP电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；pH计(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；DL-180A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；1.5 ml微型离心管(EP管)。

1.2 药品与试剂

伏立康唑标准品(中国药品食品检定研究院，批号：100862-201402，含量 99.2%)；罂粟碱(Cayman CHEMICAL 公司，批号：0476735-1，含量≥98%)；伏立康唑氮氧化物(Toronto Research Chemicals公司，批号：7-dpm-64-3，含量97%)；甲醇、乙腈(色谱纯)、氢氧化钠、磷酸二氢钠(分析纯，上海凌锋化学试剂有限公司)；空白人血浆(长海医院血库)。

1.3 数据处理软件

LcSolution版本1.26 SP1(日本岛津公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱ACE 5 C18-AR(150 mm×4.6 mm，柱号：V12-6682)，以0.025 mol/L磷酸二氢钠(含三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L的氢氧化钠调至pH为7.0)-乙腈(67∶33)为流动相，检测波长：255、276 nm(双波长检测)，流速：1.0 ml/min，自动进样器温度：4 ℃，柱温：40 ℃，进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液

2.7.1工作溶液

2.2.2内标溶液

1.4 方法 患者检查前均常规至少禁食12 h及禁水8 h，采用OLYMPUS CLV-290SL电子胃镜检查，常规循镜至十二指肠降段，检查时于十二指肠球部或(和)降段发现虫体，以活检钳钳出体外后送检。

2.3 血浆样品的预处理

分别取空白血浆、加入内标溶液的空白血浆、加入伏立康唑和伏立康唑氮氧化物及内标溶液的空白血浆、使用伏立康唑的患者血浆样品，按“2.3”项下操作进行前处理，按“2.1”项下方法检测，结果发现伏立康唑氮氧化物、罂粟碱、伏立康唑保留时间分别为4.5、11.3、13.7 min，各峰分离度均大于2，理论塔板数均大于1 000，空白血浆和流动相中干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%，并低于内标响应的5%，结果见图1。

2.4 方法专属性试验

取血浆0.3 ml于1.5 ml的EP管中，再加乙腈至1.2 ml，涡旋振荡0.5 min，13 000 r/min离心15 min，取上清液20 μl进样分析。

2.6.1批内回收率和精密度

2.5 线性关系考察

取空白血浆及伏立康唑和伏立康唑氮氧化物储备液以及罂粟碱储备液，将伏立康唑和伏立康唑氮氧化物浓度分别配制为0.5、1、2、5、10、15、20 μg/m1，内标罂粟碱浓度调为3.75 μg/m1的混合血浆样品。按“2.3”项下血浆样品预处理，按“2.1”项下色谱条件测定，以伏立康唑氮氧化物和罂粟碱面积的比值(F1)对血浆浓度(C1)进行线性回归(权重系数：1/C)，得回归方程为：F1=0.111 1 C1+0.020 0，r=0.999 5；以伏立康唑和罂粟碱面积的比值(F2)对血浆浓度(C2)进行线性回归(权重系数：1/C)，得回归方程为：F2=0.070 74C2-0.038 60，r=0.999 5。结果表明，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物在0.5～20.0 μg/m1浓度范围内呈良好线性关系。定量限浓度为0.2 μg/ml(S/N>10)。

2.6 准确度与精密度试验

总之，历史唯物主义内在具有公共性维度，这种公共性维度不仅存在于民族国家内部，也一定程度上存在于世界范围内。在一定意义上，中国倡导构建人类命运共同体就是对历史唯物主义公共性维度的运用、丰富和发展。在21世纪，构建人类命运共同体，协调人的发展与经济社会发展，需要重新思考经济社会发展与人的自由全面发展的关系，从主要关注“我”到更加重视“我们”，培育命运与共的共同体意识和共同体精神，彰显人类生活的公共性维度。

分别配制定量下限及低、中、高浓度样品(0.5、1、5、15 μg/m1)的质控(QC)血浆样品，每个浓度取5个样本，按“2.3”项方法操作，测定。根据当日的标准曲线测定QC样品的相对回收率，伏立康唑：101.3%、103.8%、94.2%、91.7%(RSD分别为6.2%、4.4%、4.7%、1.4%，n=5)，伏立康唑氮氧化物：106.8%、100.1%、94.3%、91.6%(RSD分别为6.2%、4.8%、4.7%、2.1%，n=5)。

精密称取罂粟碱适量置100 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得浓度为100 mg/L的内标储备液；取内标储备液5 ml置100 ml棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得浓度为5 mg/L的内标溶液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，备用。

虽然大家没有实际享受到摆渡人带来的方便，但泡茶馆的男人、织毛衣的女人，嘴边多了一个津津有味的话题，一个谜。在乡下人简单的生活里，一切都是日出而作，日落而息，周而复始，理所当然。但摆渡人一下子把他们的生活撕开了一条口子，让他们看到了这种生活之外的一些气息，一些他们无法解释的而又深感兴趣的元素。

取血液科服用伏立康唑(同时服用环孢素A)的临床患者的血液样品(采用EDTA抗凝管，取血量2～3 m1)，3 000 r/min离心5 min，取血浆300 μl，加5 mg/L的内标溶液至1 200 μl，涡旋振荡0.5 min，13 000 r/min离心15 min，取上清液20 μl进样分析，根据当日标准曲线定量。10例患者中，伏立康唑血药浓度在0.49～5.2 μg/m1；伏立康唑氮氧化物血药浓度在0.43～5.5 μg/m1；伏立康唑血药浓度/伏立康唑氮氧化物血药浓度的比值在0.63～20之间。在本研究过程中1名患者使用伏立康唑后，临床医生根据其血液样品监测结果对患者进行2次给药方案调整，最终使伏立康唑血药谷浓度在有效浓度范围内(1～5 μg/m1)，具体监测结果见表2。在此过程中，通过TDM监测，临床医生及时调整给药方案，避免低效治疗并降低发生不良反应的风险。

分别配制3批的定量下限及低、中、高浓度样品(0.5、1、5、15 μg/m1)的QC血浆样品，每个浓度取5个样本，按“2.3”项方法操作，分3 d进行测定，测定结果的峰面积代入相应的当日标准曲线，计算QC样品的回收率，伏立康唑：97.9%、99.6%、102.6%、101.6%(RSD分别为9.2%、5.9%、3.3%、3.6%)，伏立康唑氮氧化物：100.9%、100.0%、97.3%、98.7%(RSD分别为9.3%、6.4%、5.9%、6.7%)。

供应链管理体系是一种以市场为基准，以客户需求为中心的管理体系，充分发挥了市场在经济活动中的推动、限制、优胜劣汰等作用，是非常适合当前经济市场发展的管理模式。供应链管理体系进入中药材市场，可以有效对既有混乱、力量分散的中药材市场进行梳理和优化，中药材种植企业应当抓住供应链管理体系的重点，从药材收购入手进行发展优化。

图1 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的专属性色谱图 A.空白血浆；B.空白血浆+内标；C.空白血浆+伏立康唑对照品+伏立康唑氮氧化物对照品+内标；D.患者血浆+内标 1.伏立康唑氮氧化物；2.伏立康唑；3.罂粟碱

2.7 稳定性试验

精密称取伏立康唑标准品、伏立康唑氮氧化物标准品适量，置50 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即得400 mg/L的标准品储备液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，备用。

取伏立康唑和伏立康唑氮氧化物乙腈溶液，配成0.5、2.0、15 μg/m1浓度系列，以及罂粟碱乙腈溶液1.0 μg/m1,按“2.1”项下方法处理进样，分别于日内和日间进样测定，计算日内和日间误差。结果显示,伏立康唑日内(0、2、4、6、8 h)和日间(3 d)测得浓度的RSD分别为1.6%和1.2%；伏立康唑氮氧化物日内(0、2、4、6、8 h)和日间(3 d)测得浓度RSD分别为1.5%和2.0%；罂粟碱测得浓度RSD为1.5%。伏立康唑、罂粟碱和伏立康唑氮氧化物的乙腈溶液3 d内稳定性良好。

2.7.2血浆样品

“AA+BB”式和AB拓展式有着很大的不同。在“AA+BB”式中，AB并不是一个词，A和B有可能是单独成词，有可能重叠成AA或者BB后才能成词。如此看来便有以下三种情况：

制备伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低、高浓度(含伏立康唑氮氧化物和罂粟碱)的血浆样品，分别进行：①反复3次冻融 (-20～25℃)稳定性试验；②含药血浆样品(-20℃)放置1个月稳定性试验；③血浆样品处理后48 h稳定性试验；④血浆样品自动进样器中(4℃)放置24 h稳定性试验；⑤样品常温放置24 h稳定性试验。按“2.3”项方法操作，每个浓度取5个样本，测定结果的峰面积代入相应的当日标准曲线，计算准确度。结果由表1可见：血浆样品反复冻融3次后稳定性良好；血浆样品在-20℃条件下至少可以保存1个月；血浆样品处理后可在室温下保存48 h；处理后的血浆样品在自动进样器中(4℃)、室温中至少可保存48 h。

表1 稳定性试验结果(n=5，%)

2.8 临床标本测定应用

2.6.2批间回收率和精密度

与管材相关的影响因素包括管材与接口的影响、管材腐蚀和老化等的影响。管网漏水很多都发生在接口处，接口处往往是应力的集中点，因此容易发生接口松动、脱落甚至破裂等[2]。造成管材与接口影响的因素有很多，如接口材质老化、管道腐蚀、外部工程破坏和地面沉降等。管道在地下受各种酸碱成分、细菌的影响，管材的特性也慢慢发生变化，如果不及时淘汰很容易造成漏水，同时对城市居民的安全用水也造成威胁。一些外部工程在施工中没有弄清楚供水管网的布局，在打桩震动、勘探钻孔中极易造成供水管网的损坏。同时，随时间的推移，供水管道和路面一起在局部会发生沉降现象，这种受力不均也极易造成水管破裂、漏水。

表2 患者血药浓度监测结果(ρB/μg·ml-1)

3 讨论

3.1 检测指标成分的选择

伏立康唑主要在肝脏通过CYP450的同工酶CYP2C19代谢，主要代谢产物为无抗菌活性的伏立康唑氮氧化物，血浆中约占72%。CYP2C19酶呈基因多态性，其在不同人种、不同基因型患者的伏立康唑代谢具有明显差异。在给予相同剂量伏立康唑后，因代谢的明显差异，导致体内血药浓度变化较为明显，从而引起治疗效果不佳或者不良反应增加。本研究拟考察伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的浓度来提高治疗效果，从而达到精准治疗的目的。同时为下一步拟合CYP2C19酶多态性及伏立康唑、伏立康唑氮氧化物浓度的关系提供数据基础。

3.2 流动相的选择

伏立康唑是三唑类化合物，采用甲醇-乙腈溶剂系统流动相，干扰现象比较严重，在流动相中加入适量盐和三乙胺可抑制其拖尾，改善峰形。本研究曾分别考察了加入不同比例三乙胺、磷酸二氢钠、氢氧化钠调节pH值对峰形的影响。发现0.025 mol/L磷酸二氢钠(三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L氢氧化钠调至pH=7.0)-乙腈(67∶33)作为流动相时，峰形对称，分离效果较好，检测时间适宜，从而选择其作为流动相。

人民不再只是坐着，相信别人的胡言乱语。——诺贝尔和平奖得主格鲍伊公开表态支持“占领华尔街”运动，认为“自己的问题，只有自己解决”

3.3 提取溶媒的选择

本研究采用以乙腈为沉淀剂的蛋白沉淀法处理血液样品。采用此方法时，干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%，并低于内标响应的5%，按照《中国药典》四部通则9012生物样品定量分析方法验证指导原则，可作为提取方法。

3.4 检测波长的选择

255 nm、276 nm分别为伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的最大吸收波长，在测定部分患者血液样品时发现：检测波长为276 nm时，伏立康唑氮氧化物的干扰小，测定准确性好；检测波长为255 nm时，伏立康唑的响应值高，精密性好，所以选择双波长检测。

3.5 临床标本的测定

由于血液科用药品种多，用药方案多变，本研究采用常见的环孢素A+伏立康唑的患者作为对象，文献报道[12]：环孢素A和伏立康唑具有相互作用，伏立康唑影响环孢素A的血药浓度，同时两者均有肝毒性，本研究拟通过监测患者(同时使用环孢素A药物)伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的血药浓度，为个体化给药方案提供数据支持，为降低血液科患者这一特殊人群发生不良反应的风险做前期的研究准备工作。