Ephrin B2上调促进非小细胞肺癌上皮间质转化及转移

江义霞 李匡政 席云祝 刘 青 贾远航

(南华大学附属第二医院呼吸内科，衡阳421001)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是当前全球范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，明确其发病机制是对该病进行治疗的关键[1，2]。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肺癌发生转移的重要和起始环节[3]。Ephrin B2作为酪氨酸激酶受体/配体家族中的一员，其能够通过细胞间的相互排斥作用，对神经元细胞和血管的形成和发育起调控作用[4]。近年来有研究发现，Ephrin B2在多种肿瘤中均存在异常表达现象，且与肿瘤的转移呈明显正相关[5]。但Ephrin B2表达与NSCLC发生和发展的关系尚未见报道。因此，本研究旨在通过检测肺癌和癌旁正常肺组织中Ephrin B2以及标记蛋白和与促肿瘤转移因子的表达，探讨Ephrin B2与NSCLC上皮间质转化及转移之间的关系。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 收集我院病理科10年间肺癌手术切除蜡块标本98例，同时取癌旁正常肺组织蜡块34例作为对照。98例NSCLC患者中，男67例，女31例，年龄41～75岁，鳞癌59例，腺癌33例，有淋巴结转移者58例，无淋巴结转移者40例，依据2009年国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)第七版分期标准：Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ期45例。本研究所有入组标本临床资料及随访完整，并经我院伦理委员会审批同意。

1.1.2主要试剂 山羊血清封闭液购自北京康为世纪生物科技有限公司，鼠抗人Ephrin B2单克隆抗体、生物素标记的兔抗鼠IgG工作液由北京义翘神州科技有限公司 提供，Western blot中抗体购自英国Abcam公司，人肺腺癌A549细胞由美国菌种保藏中心(ATCC)提供。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学 取甲醛固定标本，石蜡包埋后切片并置于60℃温箱烘1 h，使用二甲苯、梯度酒精、蒸馏水对切片进行处理。高原抗压修复后PBS冲洗，加入10%正常山羊血清封闭液、鼠抗人Ephrin B2单克隆抗体、生物素标记的兔抗鼠IgG二抗工作液、链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液。PBS冲洗、DAB显色、1%氨水返蓝后使用梯度酒精脱水。各切片选择5个高倍镜视野，依据着色强度和阳性细胞比值判定免疫组化结果。结果判读由专业病理科医师采用双盲法判定(重复实验3次)。

1.2.2细胞培养、分组与转染 将人A549细胞进行培养后选取第3代细胞分为4组：空白组(Blank组)，不转染任何序列；阴性对照(NC组)；Ephrin B2 vector组，用脂质粒体方法转染Ephrin B2过表达质粒；sh-Ephrin B2组，用脂质粒体方法转染含有Ephrin B2干扰片段的质粒，将处于对数生长期的细胞置于6孔板中继续培养后转染。转然后使用250 μl 不含血清培养基Opti-MEM对各组细胞稀释后继续培养进行后续实验。

1.2.3qRT-PCR实验 提取转染后各组A5490 NSCLC细胞中总RNA。使用Premier 5.0软件进行qRT-PCR引物设计，并由Invitrogen设计合成Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin，Vimentin以及MMP-2引物，GAPDH做内参照，引物序列见表1。使用PrimeScript RT试剂盒(RR036A，TaKaRa)将RNA逆转录成cDNA，逆转录体系10 μl，参照说明书进行以2 μg总RNA为模板，用GAPDH作为内参引物采用相对定量法(2-ΔΔCt法)计算目的基因Ephrin B2、E-cadherin(上皮细胞标记蛋白)、N-cadherin，Vimentin(间质细胞标记蛋白)、MMP-2 mRNA的相对转录水平：ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参)。实验重复3次。

1.2.4Western blot实验 提取各组细胞总蛋白并测定蛋白浓度，将分离蛋白转移至NC膜，5% BSA室温下封闭1 h。滴加一抗兔多抗Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2后于4℃过夜。PBS冲洗后孵育HRP 标记的兔抗人IgG抗体。室温下膜与ECL液反应1 min。吸去液体，覆盖保鲜膜，拍摄X光片。以GAPDH作内参，以目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达量。实验重复3次。

1.2.5划痕实验 转染48 h后收集各组A549 NSCLC细胞，以1×105/孔的密度接种于6孔板，借助无菌200 μl Tip头在同等力度下在每个孔底部横竖各划4条痕，弃去原培养液，每孔加入无血清培养液2 ml并且将其置于培养箱中培养，分别在划痕后的第0、24小时后于倒置显微镜下拍照，各样本均取5个视野细胞计数的平均值，对划痕点宽度进行测量，计算各组划痕愈合率，划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%，测量连续进行3次，依据结果评价各组细胞迁移能力。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

Target geneUpstream primer(5′-3′)Downstream primers(5′-3′)Ephrin B2ATGACAAGCTCTACCAGAGAGACCACATTAGTGGTGACTGTTGGAAE-cadherinCGAGAGCTACACGTTCACGGGGGTGTCGAGGGAAAAATAGGN-cadherinTTTGATGGAGGTCTCCTAACACCACGTTTAACACGTTGGAAATGTGVimentinGCCCTAGACGAACTGGGTCGGCTGCAACTGCCTAATGAGMMP-2AGATCTTCTTCTTCAAGGACCGGTTGGCTGGTCAGTGGCTTGGGGTAGAPDHAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCGCCCAATACGACCAAATC

Note：MMP-2.Mitochondrial membrane potentia；GAPDH.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2 结果

2.1NSCLC组织和癌旁正常组织中Ephrin B2蛋白表达阳性率 免疫组化检测NSCLC患者的组织石蜡标本以及癌旁组织中的Ephrin B2蛋白表达情况显示(图1)，Ephrin B2在NSCLC组织和癌旁组织中均存在表达，胞核内见到黄色颗粒为阳性细胞。肺癌组织和癌旁组织中呈现Ephrin B2蛋白高表达的共55例和7例，肺癌组织Ephrin B2蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常组织(P<0.05)。对Ephrin B2蛋白表达情况与患者临床参数之间的关联进行分析发现，Ephrin B2表达与患者性别、年龄、分期、病理类型及分级等参数没有直接关系(P>0.05)，见表2。

2.2qRT-PCR检测A549细胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表达 qRT-PCR检测A549细胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表达结果显示(图2)： Blank组与NC组间差异无统计学意义(P>0.05)；与Blank组相比，Ephrin B2 vector组Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表达上升(P<0.05)，E-cadherin mRNA表达水平下降(P<0.05)。sh-Ephrin B2组Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表达水平下降(P<0.05)，E-cadherin mRNA表达水平上升(P<0.05)。

2.3Western blot检测A549细胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达 Western blot检测A549细胞Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达结果显示(图3)： Blank组与NC组间差异无统计学意义(P>0.05)；与Blank组相比，Ephrin B2 vector组Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达上升(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达水平下降(P<0.05)。sh-Ephrin B2组Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达水平下降(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达水平上升(P<0.05)。

图1 Ephrin B2蛋白在NSCLC和正常组织中的表达(×200)Fig.1 Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues and normal tissues(×200)Note: Normal.Expression of Ephrin B2 protein in normal lung tissue(IHC score：1)；Tumor-L.Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues that was stained weakly positive(IHC score：2)；Tumor-H.Expression of Ephrin B2 protein in NSCLC tissues that was stained strongly positive(IHC score：16).

表2 Ephrin B2表达与NSCLC临床特征的关系

Tab.2 Relationship between expression of Ephrin B2 and clinical features of NSCLC

FeaturesEphrin B2Low expressiongroupHigh expressiongroupχ2PSmokingNon smoker9110.0000.992Smoker3543Chronic cardiopulmonary diseaseYes24260.3970.529No2028Clinical stagesⅠ-Ⅱ26270.4580.499Ⅲ1926Metastasis(pN)Yes28300.6550.418No1624Pathological typeSquamous cell carcinoma28310.4420.802Adenocarcinoma1518Others24Organization classificationModerate and highdifferentiation28422.3760.123Poor differentiation1612

图2 A549细胞中Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表达的差异Fig.2 mRNA expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell linesNote: Compared with blank group，*.P<0.05.

图3 A549细胞中Ephrin B2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达差异Fig.3 Protein expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell linesNote: A.Protein expression profile;B.Protein expression of Ephrin B2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin in A549 cell lines.Compared with blank group，*.P<0.05.

图4 各组细胞的迁移能力差异Fig.4 Differences of migration and invasionability in A549 cell linesNote: A.Cell scratch test′s result of A549 cell lines;B.Bar graphof cell migration experiment result in A549 and H520 cell lines.Compared with blank group,*.P<0.05.

2.4Ephrin B2与A549细胞的迁移作用关系 划痕实验结果显示(图4)：Blank组与NC组间差异无统计学意义(P>0.05)；与Blank组比较，Ephrin B2 vector组NSCLC细胞迁移上升(P<0.05)；sh-Ephrin B2组NSCLC细胞迁移下降(P<0.05)。

3 讨论

Eph(Erythropoietin producing hepatocellular carcinoma cell line)是当前已知的最大的受体型酪氨酸激酶家族，其在人体的病理和生理过程中均扮演着重要角色[6]。Ephrin(Eph family receptor interacting proteins)为Eph的配体，受体能够和配体通过相互接触而结合，被对方激活进而实现磷酸化和信号转导[7]。Ephrin B2作为一种跨膜蛋白，近年来被发现广泛存在于鼻咽癌、肝癌以及乳腺癌等恶性肿瘤中[8-10]。

本研究利用免疫组化方法对NSCLC患者肺癌组织以及癌旁正常肺组织中Ephrin B2蛋白的阳性表达进行检测发现，Ephrin B2蛋白在肺癌组织中的表达(56.12%)显著高于其在癌旁正常肺组织中的表达(20.59%)，且差异存在统计学意义(P<0.05)。分析Ephrin B2蛋白表达与患者临床参数之间的关联，二者之间不存在直接关系(P>0.05)。有研究在探讨Ephrin B2蛋白在胶质瘤中的表达时发现Ephrin B2与肿瘤基因R-Ras存在关联，Ephrin B2受体能够激活Ras-MARK以及ATK信号途径。该系统能够对细胞分裂素活化蛋白激酶通路进行调节，进而促进肿瘤细胞的生成，增强其侵袭性[11]。另外，关于Ephrin B2表达与子宫内膜癌关系的研究显示，Ephrin B2以及EphB4二者在子宫内膜癌组织中的表达均显著升高，且二者存在相关性[12]。提示EphB4可能通过与Ephrin B2相结合并且激活Ephrin B2来实现促进子宫内膜癌新生血管生成、促进其发生和转移的目的。本研究观察NSCLC组织中Ephrin B2的表达以及NSCLC组织上皮间质转化和转移情况，肺癌组织中间质标记蛋白以及促肿瘤转移因子的蛋白和mRNA表达相对于癌旁组织显著升高(P<0.05)。提示NSCLC上皮间质转化及转移能力更强。qRT-PCR筛选出肺腺癌和肺鳞癌A549和H520细胞系后，检测Ephrin B2基因和NSCLC上皮间质转化以及转移相关标志性因子的mRNA和蛋白表达水平结果发现，与Blank组与NC组相比，Ephrin B2 vector组Ephrin B2、 N-cadherin、Vimentin和Fibronectin mRNA以及蛋白的表达均显著上升(P<0.05)，而上皮标记蛋白的mRNA以及蛋白表达均显著下降。进一步说明了Ephrin B2基因在促进NSCLC上皮间质转化中的作用。另外，Ephrin B2 vector组中上皮间质转移相关因子的表达显著增强，提示Ephrin B2基因能够促进NSCLC上皮间质转移。划痕实验进一步显示，Ephrin B2上调在促进A549和H520 NSCLC细胞的迁移和侵袭中其重要作用。Kore等[13]在探究Ephrin B2表达与胶质瘤的恶性程度的关系时发现，Ephrin B2表达与肿瘤的恶性程度呈正相关。Ephrin B2表达对肿瘤的侵袭、恶性程度的增强起推动作用[14]。与本研究中结果一致。我们使用Hoechst33342/PI核荧光双染对两组细胞系细胞凋亡情况进行检测发现，Ephrin B2上调能够促进A549和H520 NSCLC细胞的凋亡，这可能与随着时间的延长，各组细胞缺乏营养存在一定关联。而使用CCK-8法以及细胞平板克隆形成实验对两组细胞系的增殖和克隆情况进行检测发现，Ephrin B2上调能够促进A549和H520 NSCLC细胞的增殖和克隆。进一步证实了Ephrin B2与肿瘤的生长、分化之间的关联。

综上所述，Ephrin B2在肺癌中高表达，Ephrin B2与NSCLC上皮间质转化及转移存在关联，抑制Ephrin B2的表达，能够抑制NSCLC上皮间质转化及转移。Ephrin B2有望成为治疗肺癌治疗新的靶点。