miR-155在TGF-β1诱导足细胞损伤中的表达及其与synaptopodin、CD2AP表达的相关性①

郑心彤 凌霄雁 古贤君 林 栩 黄海庭 吴好好 钟秋红 尤燕舞 唐奇燎

(右江民族医学院附属医院，百色533000)

足细胞锚定在肾小球基底膜上，维持着肾小球的结构，是肾小球滤过膜的重要组成部分。足细胞数量减少、结构及功能异常可导致蛋白尿并最终发展为肾小球硬化，参与了许多肾脏疾病发生发展的过程。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一种内源性小分子非编码RNA，其生物学效应的发挥，主要是通过与靶基因3′非翻译区结合，从而实现对靶蛋白的调节。生物信息学研究结果表明，人类miRNA的靶基因至少有上千个，而受miRNA调控的靶基因更是达五千多个，广泛参与了机体生理、病理调控的各个过程[1]。Dicer敲除小鼠模型中，小鼠出现大量蛋白尿和严重的肾损害，足细胞骨架蛋白发生改变，这使学者们注意到miRNA与足细胞间的关系[2]。

本研究采用转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)-β1诱导足细胞构建细胞损伤模型，通过建立不同浓度、不同时间梯度TGF-β1干预组，检测各组足细胞损伤标志物synaptopodin、CD2AP的mRNA、蛋白表达以及足细胞中miR-155的表达变化，从而探索miR-155与足细胞损伤之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料 肾小球足细胞株(MPC5)购于上海复旦大学细胞中心，RPMI1640 培养基(美国Gibco)、胎牛血清(中国Cellmax)、重组人TGF-β1(美国PeproTech)、synaptpotodin抗体(21064-1-AP)、CD2AP抗体(51046-1-AP)、GAPDH抗体(10494-1-AP)(美国Proteintech)，磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物(北京康为世纪)，BCA蛋白定量试剂盒(中国碧云天公司)，RNAiso Plus RNA提取试剂盒(9108)、SYBR Premix Ex TaqTMII(RR820A)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)，(日本TaKaRa)，Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit (638315，美国clontech)，PCR引物合成(大连宝生物工程有限公司)，引物序列见表1(miR-155引物序列为其专利，U6引物由clontech试剂盒提供，均不提供具体碱基序列)，CCK8 试剂盒(日本同仁化学研究所)。

1.2方法

1.2.1足细胞培养 培养方法参照本课题组的前期研究，并稍作修改[3]。细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2环境中传代培养。2～3 d换液 1 次。细胞融合至80%左右消化传代，14 d左右分化成熟后用于相关实验。

1.2.2TGF-β1处理及分组 细胞传代后，以0.4～1×105个细胞种于6孔板中，待各组细胞融合至60%～70%后用含1%胎牛血清的 RPMI1640 培养液同步化24 h不同浓度TGF-β1作用72 h分组：0 ng/ml组、4 ng/ml组、8 ng/ml组、12 ng/ml组。12 ng/ml TGF-β1作用不同时间分组：0 h组、24 h组、48 h组、72 h组。提取总RNA、总蛋白。

1.2.3CCK8法检测细胞增殖 将各组细胞按 1×104个/孔接种于96孔板，每孔终体积为100 μl，每组设3个复孔，同时设置空白孔。24 h待细胞贴壁以后更换原培养液，向培养板各组细胞加入相应浓度梯度含TGF-β1的培养液。在培养箱中孵育到各自时间点后，每孔加入10 μl CCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)。细胞存活率=[(实验组OD值-空白组OD值)÷(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.2.4Real-time RT-PCR检测 按照说明用 RNAiso Plus提取各实验组小鼠足细胞的总RNA。经紫外分光光度计测定OD260、OD280及RNA浓度、琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。取1μg总RNA反转录合成cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。使用LightCycler®96 实时荧光定量PCR仪进行检测。选取GAPDH和U6作为mRNA和miRNA的内参，检测miR-155、U6、synaptopodin、CD2AP、GAPDH的mRNA表达。以2-ΔΔCT法计算相对表达量，ΔΔCT=(CT实验组目的-CT实验组内参)-(CT对照组目的-CT对照组内参)。

1.2.5Western blot法检测 收集处理好的各实验组足细胞，提取总蛋白。以二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，取30～50 μg蛋白加入5×SDS上样缓冲液煮沸变性后，于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，300 mA恒流湿转至PVDF膜，封闭液室温封闭1 h，分别加入一抗稀释液稀释的synaptopodin(1∶500)、CD2AP(1∶500)、GAPDH(1∶2 000)抗体，4℃孵育过夜，洗涤3次，加入相应的抗兔IgG-HRP二抗，室温孵育1 h，洗涤3次，增强化学发光(ECL)显影，利用Image J软件进行半定量分析，以目的条带与同个样品GAPDH灰度值的比值表示相对光密度值。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

Tab.1 Primers of qRT-PCR

NameForward primer(5′-3′)Reverse primer(5′-3′)SynaptopodinGCTCGAATTCCGATGCAAATAAACCAGGCCACAGTGAGATGTGAAGACD2APAGGAATTCAGCCACATCCACACGATCAATTCCAGTTCGTCCTCGAPDHTGTGTCCGTCGTGGATCTGATTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG

2 结果

2.1TGF-β1干预对体外培养的小鼠足细胞增殖活性的影响 不同剂量的TGF-β1(4、8、12 ng/ml)作用于足细胞，干预时间为24 h时对细胞增殖活性的影响不大(P>0.05)，但从48 h开始细胞存活率不同程度降低，细胞增殖活性受到抑制，差别有统计学意义(P<0.05)(图1)。

2.2TGF-β1诱导足细胞损伤对miR-155表达的影响 正常对照组中miR-155的表达量较低，使用8、12 ng/ml TGF-β1干预足细胞72 h后，miR-155表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，而4 ng/ml组与正常对照组miR-155相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。使用12 ng/ml TGF-β1干预足细胞48、72 h后，miR-155表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，而24 h组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

2.3TGF-β1诱导足细胞损伤对synaptopodin、CD2AP mRNA表达的影响 与正常对照组相比，8、12 ng/ml TGF-β1干预足细胞72 h后，synaptopodin、CD2AP mRNA表达均下调(P<0.05)。4 ng/ml组与正常对照组synaptopodin、CD2AP mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。12 ng/ml TGF-β1干预足细胞48、72 h后， synaptopodin、CD2APmRNA表达均下调(P<0.05)。当24 h组与正常对照组synaptopodin、CD2AP mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)(表5)。

图1 TGF-β1干预足细胞后的细胞存活率Fig.1 Cell survival rate of TGF-β1 on podocyteNote: Compared with the 0 ng/ml group,# .P<0.01.

GroupsnmiR-1550 ng/ml31.00±0.004 ng/ml31.21±0.088 ng/ml31.71±0.101)12 ng/ml32.20±0.122)

Note：Compared with the 0 ng/ml group,1)P<0.05,2)P<0.01.

2.4TGF-β1诱导足细胞损伤后对synaptopodin、CD2AP蛋白表达的影响 与正常对照组相比，8、12 ng/ml TGF-β1干预足细胞72 h后，synaptopodin、CD2AP蛋白表达均下调(P<0.05)，4 ng/ml组与正常对照组synaptopodin、CD2AP蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。12 ng/ml TGF-β1干预足细胞48、72 h后，synaptopodin、CD2AP 蛋白表达均下调(P<0.05)，24 h组与正常对照组synaptopodin、CD2AP 蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

GroupsnmiR-1550 h31.00±0.0024 h31.07±0.1648 h31.29±0.051)72 h32.00±0.062)

Note：Compared with the 0 h group,1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsnSynaptopodin mRNACD2AP mRNA0 ng/ml31.00±0.001.00±0.004 ng/ml30.83±0.070.94±0.038 ng/ml30.62±0.041)0.66±0.061)12 ng/ml30.30±0.022)0.47±0.012)

Note：Compared with the 0 ng/ml group,1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsnSynaptopodin mRNACD2AP mRNA0 h31.00±0.001.00±0.0024 h30.78±0.100.78±0.1248 h30.60±0.081)0.63±0.041)72 h30.30±0.012)0.47±0.012)

Note：Compared with the 0 h group,1)P<0.05,2)P<0.01.

2.5Pearson相关分析 不同浓度、不同时间TGF-β1干预足细胞，synaptopodin蛋白与mRNA表达呈正相关，相关系数r分别为0.921、0.941，CD2AP蛋白与mRNA表达呈正相关，相关系数r分别为0.753、0.879，差异均有统计学意义(P<0.01)(图4)。不同浓度、不同时间TGF-β1干预足细胞，synaptopodin蛋白与miR-155表达呈负相关，相关系数r分别为-0.907、-0.962；CD2AP蛋白与miR-155表达呈负相关，相关系数r分别为-0.794、-0.819，差异均有统计学意义(P<0.01)(图5)。不同浓度、不同时间TGF-β1干预足细胞，synaptopodin mRNA与miR-155表达呈负相关，相关系数r分别为-0.985、-0.925，CD2AP mRNA与miR-155表达呈负相关，相关系数r分别为-0.963、-0.832，差异均有统计学意义(P<0.01)(图6)。

图2 不同浓度TGF-β1干预足细胞对synaptopodin、CD2AP 蛋白表达的影响Fig.2 Effects of TGF-β1 on synaptopodin,CD2AP protein expression in podocyte at different concentrationNote: A.Western blot;B.A summary graph for the densitometry values of the target protein.Compared with the 0 ng/ml group,*.P<0.05,#.P<0.01.

图3 TGF-β1干预足细胞不同时间对Synaptopodin、CD2AP 蛋白表达的影响Fig.3 Effects of different times of TGF-β1 on synaptopodin,CD2AP protein expression in podocyteNote: A.Western blot;B.A summary graph for the densitometry values of the target protein.Compared with the 0 h group,*.P<0.05,#.P<0.01.

图4 Synaptopodin、CD2AP蛋白和mRNA的相关性Fig.4 Correlation between synaptopodin,CD2AP protein and mRNA

图5 Synaptopodin、CD2AP蛋白和miR-155的相关性Fig.5 Correlation between synaptopodin,CD2AP protein and miR-155

图6 Synaptopodin、CD2AP mRNA和miR-155的相关性Fig.6 Correlation between synaptopodin,CD2AP mRNA and miR-155

3 讨论

足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分，许多肾脏疾病均出现不同程度的足细胞损伤[4]。骨架蛋白功能和结构的改变，是足细胞损伤的中心环节。TGF-β1是足细胞损伤常见的炎症因子之一，参与了肾脏疾病肾小球硬化的过程，在体外培养的足细胞损伤模型中被广泛应用。TGF-β1损伤足细胞的过程与核因子kappa-B、磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶等通路的激活有关[5,6]。本研究使用TGF-β1构建足细胞损伤模型，对其具体机制进一步探究。使用不同浓度、不同时间梯度的TGF-β1干预足细胞并采用CCK8法检测其增殖活性，结果显示，一定浓度的TGF-β1可抑制足细胞增殖，从而降低细胞存活率，这与我们课题组之前的研究结果一致[7]。

成熟的miRNA可通过促进降解或抑制翻译在转录后调节靶mRNA的表达水平，广泛参与了细胞增殖凋亡、人体病理生理以及疾病发展预后等过程。由于尿液中的miRNA被包裹在囊泡中表达相对稳定，这使得miRNA有望成为新的诊断标志物[8]。近年来，越来越多的研究表明miRNA与肾脏疾病发生发展的过程密切相关[9,10]。此外，在第十一届国际足细胞会议中，许多学者对足细胞中miRNA的重要作用做出总结，有学者检测到膜性肾病患者的足细胞中存在多种特异性miRNAs，糖尿病患者足细胞中miR-146a的差异表达与免疫系统失调密切相关；新月体性肾炎患者的足细胞中miRNA92a表达上调并调控足细胞中细胞周期调节因子p57最终导致细胞静止，miRNA92a靶基因之一转录激活子3也在多种肾小球疾病中表达上调[11]。众多miRNA中，miR-155和miR-146与免疫应答关系密切，也是研究最多的[12]。然而，miR-155在肾脏疾病中作用的研究较少。有研究显示，与健康对照组相比，狼疮肾炎患者的肾脏组织中miR-155的表达上调[13]。本课题组前期的研究发现，肾小球疾病患者出现了足细胞损伤及miR-155表达上调，miR-155敲除小鼠模型中足细胞标志蛋白Nephrin乙酰化，肾脏损害减轻，这表明miR-155在足细胞损伤过程中发挥重要作用，可能是肾脏疾病足细胞损伤诊断和治疗的潜在靶点[14]。然而miR-155在TGF-β1诱导的足细胞损伤中表达如何变化及其可能的分子机制仍不明确。本研究，我们采用Real-time RT-PCR检测miR-155的相对表达量，发现在TGF-β1诱导足细胞损伤模型中，miR-155的表达水平上调，并且在一定范围内呈剂量、时间依赖性，这提示我们，miR-155可能参与了TGF-β1诱导足细胞损伤的过程。

synaptopodin是分化成熟足细胞的骨架蛋白之一，和紧密连接蛋白MAGI-1一起与动蛋白微丝紧密相连，可将足细胞肌动蛋白骨架从活动性转变为收缩性，维持足细胞的功能结构，稳定肾小球滤过[15]。synaptopodin表达变化将影响足细胞的生理功能，改变肾小球滤过膜的通透性并导致蛋白尿。CD2AP衔接着T细胞和抗原呈递细胞，发现时被认为是免疫分子又被称为“免疫突触”，而后证实CD2AP在多种组织中均有表达，在肾脏中主要分布于足细胞，包埋在足细胞裂孔隔膜的脂筏中[16]。CD2AP不仅在足细胞结构和功能的维持中发挥重要作用，还维持着免疫系统稳定。当synaptopodin、CD2AP表达发生变化，意味着足细胞的结构和功能改变。然而在TGF-β1诱导的足细胞损伤模型中，synaptopodin和CD2AP表达如何变化及其与足细胞中miR-155表达变化的关系，至今未见报道。本研究结果证实，TGF-β1诱导足细胞损伤的过程中，synaptopodin和CD2AP mRNA和蛋白的表达均下调，并且在一定范围内呈剂量、时间依赖性，这与先前的理论、研究以及预测的实验结果相一致，TGF-β1成功诱导构建了足细胞损伤模型。通过Pearson相关分析我们发现，synaptopodin、CD2AP的mRNA和蛋白表达呈正相关且均与miR-155的表达呈负相关，这充分说明了miR-155的表达水平可能与足细胞的损伤程度有关。

足细胞结构完整和功能正常对维持肾脏生理功能至关重要，miR-155广泛调控基因表达，其靶基因与足细胞损伤的多条信号通路相关[17]。我们的研究发现TGF-β1诱导足细胞损伤使足细胞增殖抑制，synaptopodin、CD2AP mRNA和蛋白表达下调，miR-155表达上调，miR-155可能是参与TGF-β1诱导足细胞损伤的重要因子，对肾脏疾病发病机理的研究至关重要。然而，miR-155在足细胞损伤中的具体机制有哪些，在临床肾脏疾病的防治中如何运用，我们课题组将进行更深入地研究。