抑制EZH2表达对宫颈癌细胞凋亡的影响及机制

段继惠，杨磊，穆红，唐志琴

(天津市第一中心医院，天津300190)

宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一[1,2]。鳞状细胞癌是宫颈癌最常见的组织学类型[3]。病灶内癌细胞的增殖和凋亡涉及多基因的异常表达，探讨宫颈癌的分子调控机制以获取有效的治疗靶点，是改善宫颈癌患者预后的重要研究课题。人类Zest同源增强子(EZH2)基因是多梳家族(PcG)蛋白家族成员之一，它通过特异性地使基因启动子区域组蛋白H3赖氨酸27发生甲基化，参与众多基因的转录沉默。研究表明，EZH2在多种恶性肿瘤中表达水平增高[4,5]。在肿瘤生物学领域，为提高抗癌疗效的特异性，分子靶向治疗已引起广泛关注。3-去氮腺嘌呤(DZNep)是一种能够使染色体重塑的化合物，有研究表明，DZNep可以抑制EZH2的表达[6～8]。2017年10月～2018年6月，我们对宫颈癌细胞进行DZNep干预，观察抑制EZH2表达对宫颈癌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响，为以EZH2为靶点的宫颈癌治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 根据本课题组前期研究所得Western blotting结果，选择EZH2蛋白表达较高的人宫颈癌细胞系Siha和C33A细胞，Siha细胞由天津市第一中心医院重点实验室保存，C33A购自中国医学科学院。DMEM培养基、胎牛血清及胰酶购自美国Gibco公司；四甲基噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自天津莱博生物有限公司；Annexi Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒；Western blotting相关试剂及主要抗体购自上海碧云天生物有限公司。

1.2 细胞培养 Siha和C33A细胞常规置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中(加青霉素100 U/mL及链霉素100 μg/mL)，在37 ℃、5% CO2条件下的培养箱中培养。0.25%胰酶溶液消化，传代，选用对数生长期的细胞进行实验。

1.3 两种细胞DZNep半数抑制浓度(IC50)值的确定 采用MTT法。将处于对数生长期的Siha和C33A细胞分别接种于96孔板。每孔细胞1×105个，培养12 h后分别加入梯度浓度的DZNep(0、0.2、0.6、1、2、4、6、8、10 μmol/L)，每个浓度设置3个复孔，另设对照孔(不加DZNep)和空白对照孔(DMEM+MTT+ DMSO)。细胞培养48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，全自动酶标仪读取各孔吸光度值，波长设定为490 nm，实验共重复3次。MTT结果显示，随着DZNEP浓度的增加，Siha和C33A细胞吸光度值均逐渐减小，有增殖活力的细胞数量逐渐减少，细胞的抑制率逐渐增加，Siha和C33A细胞的IC50分别为6 μmol/L和4 μmol/L，用于后续实验。

1.4 细胞凋亡情况检测 采用流式细胞仪。宫颈癌细胞株以5×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁生长至瓶底的80%，于对数生长期时弃去原培养液，加入DZNep处理。分为DMSO组、1/2 IC50组和IC50组，分别以DZNep终浓度0、3、6 μmol/L处理Siha细胞各组，以0、2、4 μmol/L处理C33A细胞各组。培养48 h后收集各组细胞，PBS洗涤2次，用1×buffer重悬细胞，取100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和1 μL PI(100 mg/L)，室温避光放置15 min，再加入400 μL 1×buffer，混匀后上机检测细胞早期凋亡率。实验重复3次，结果取平均值。

1.5 EZH2及相关凋亡蛋白表达检测 采用Western blotting法检测EZH2蛋白、抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-X基因长片段(Bcl-xL)、促凋亡蛋白Bcl-2家族细胞凋亡相互作用因子(Bim)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达。将细胞分为DMSO组、1/2 IC50组和IC50组。取细胞培养悬液加入裂解液，提取细胞蛋白并进行定量。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳并转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分别用稀释度1∶400的相应一抗 (EZH2、Bcl-xL、Bim、Caspase-3)，4 ℃过夜后加碱性磷酸酶(AP)标记的相应二抗IgG(1∶5 000)室温下孵育120 min，以β -肌动蛋白(β-actin)为内参分析目的蛋白的表达，利用增强型化学发光试剂(ECL)显色条带显色，X线胶片曝光。实验重复3次，Quantity One软件计算吸光度积分值分析算出相应蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞早期凋亡率比较 在Siha、C33A细胞中，1/2 IC50组、IC50组早期凋亡率均高于DMSO组(P均<0.05)，IC50组早期凋亡率均高于1/2 IC50组(P均<0.05)。见表1、图1。

2.2 Siha和C33A细胞中EZH2蛋白表达比较 在Siha、C33A细胞中，IC50组EZH2蛋白表达均低于1/2 IC50组、DMSO组(P均<0.05)。见表1、图2。

2.3 Siha和C33A细胞中凋亡相关蛋白表达比较 在Siha、C33A细胞中，IC50组Bcl-xL蛋白表达均低于1/2 IC50组、DMSO组，Bim和Caspase-3蛋白表达均高于1/2 IC50组、DMSO组(P均<0.05)。见表2、图2。

注：A和D为DMSO组；B和E为1/2 IC50组；C和F为IC50组。

表1 Siha、C33A细胞中各组细胞早期凋亡率及EZH2蛋白 表达比较

注：与DMSO组比较，*P<0.05；与1/2 IC50组比较，﹟P<0.05。

3 讨论

EZH2是组成多梳蛋白抑制复合物多梳蛋白抑制复合体2(PRC2)的核心亚基，在肿瘤的发生发展过程中可能有重要作用[9,10]。近年研究显示，EZH2在宫颈癌组织中异常高表达，抑制EZH2表达可延缓肿瘤的发生发展[11,12]。探索以EZH2为靶点的基因治疗是近年宫颈癌治疗研究的方向之一。

表2 Siha、C33A细胞中凋亡相关蛋白表达比较

注：与DMSO组比较，*P<0.05；与1/2 IC50组比较，﹟P<0.05。

DZNep是3-脱氮腺苷类似物，它能诱导PRC2复合物包括EZH2的降解[13]。研究表明，DZNep具有抗肿瘤活性，对胃癌、前列腺癌、黑色素瘤中高表达的EZH2有明显抑制作用[6,14,15]。EZH2是一种致癌基因，它可以特异性地使组蛋白H3的第27位点的赖氨酸(H3K27)三甲基化(H3K27me3)，从而使下游靶基因沉默，与肿瘤的发生和发展密切相关。DZNep通过抑制组蛋白甲基转移酶EZH2诱导肿瘤细胞的凋亡[16]。作为EZH2的小分子抑制剂，DZNep对肿瘤的潜在治疗作用备受临床医生的关注。本研究结果显示，在Siha、C33A细胞中，1/2 IC50组、IC50组早期凋亡率均高于DMSO组，提示DZNep能够明显促进Siha和C33A细胞的凋亡，浓度较高时抑制作用更强；在Siha、C33A细胞中，IC50组EZH2蛋白表达均低于1/2 IC50组、DMSO组，提示DZNep能够明显抑制EZH2蛋白的表达水平，而且DZNep的浓度越高，抑制作用越明显。

抗凋亡是肿瘤细胞进展中普遍存在的特点，因此研究如何促进肿瘤细胞发生凋亡可为治疗肿瘤提供新的方向和靶点。凋亡信号的产生来自于细胞的不同部位，如线粒体、内质网或细胞表面的死亡受体，最终由半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族的成员来完成，其中Caspase-3的活化是凋亡发生的重要标志[17]。Bcl-xL属于Bcl-2家族成员，通过阻止线粒体外膜上Bax/Bak寡聚体的形成来发挥其抗凋亡作用[18]；而Bcl-2家族的另一成员Bim的作用与Bcl-xL的功能截然相反[19]，具有促凋亡的作用。Bim只含有BH3结构域，它是线粒体凋亡的始动者，受到转录和翻译后两个水平的调节。活化的Bim分子移位到线粒体膜，使线粒体外膜上的Bax/Bak活化，膜通透性发生改变，形成凋亡小体，导致细胞凋亡。本研究结果显示，在Siha、C33A细胞中，IC50组Bcl-xL蛋白表达均低于1/2 IC50组、DMSO组，Bim和Caspase-3蛋白表达均高于1/2 IC50组、DMSO组，提示DZNep可使宫颈癌细胞中Bcl-xL表达降低，而使Bim和Caspase-3蛋白表达增高，结合本研究所得细胞凋亡率结果，考虑DZNep可以通过抑制EZH2的表达，进而下调抗凋亡蛋白Bcl-xL表达并上调促凋亡蛋白Bim、Caspase-3表达，从而促进宫颈癌细胞凋亡。

注：A和D为 DMSO组；B和E为1/2 IC50组；C和F为IC50组。

本研究结果表明，利用DZNep靶向下调宫颈癌细胞系Siha和C33A中EZH2的表达后，能够诱导宫颈癌细胞早期凋亡，其机制可能与抑制EZH2的表达，进而下调Bcl-xL蛋白表达并上调Bim和Caspase-3蛋白表达有关，为后续动物实验和临床应用提供了实验依据。