白藜芦醇对糖尿病肾病小鼠肾脏氧化应激及肾组织Nrf2通路蛋白表达的影响

高丝娜，李英，迟雁青，刘翠红，曹义甫

(1石家庄市第三医院，石家庄050000；2河北医科大学第三医院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症。近年来，DN的发病率呈逐年上升的趋势，已成为终末期肾衰竭的主要原因之一。因此，明确DN的发病机制及有效的防治措施是当前备受关注的研究热点。大量研究表明，氧化应激是DN的主要病理生理机制。核转录因子(NF)E2相关因子2(Nrf2)是细胞氧化应激反应中的关键因子，是细胞抗氧化还原的中枢调节者，Nrf2通过与抗氧化反应元件(ARE)相互作用，即Nrf2/ARE通路在细胞的防御保护中发挥重要作用[1]。血红素氧合酶1(HO-1)是受Nrf2调节的比较重要的一种抗氧化酶。白藜芦醇是一种多酚类植物抗毒素，近年研究表明，白藜芦醇可能通过抑制氧化应激发挥对DN的保护作用。2018年，本研究旨在研究白藜芦醇是否通过激活Nrf2通路来抑制DN的氧化应激损伤，我们观察了白藜芦醇对DN小鼠肾脏氧化应激反应及Nrf2通路蛋白表达的影响，探讨白藜芦醇对DN小鼠肾脏的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 雄性CD-1小鼠100只，体质量20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司(S0130)；白藜芦醇购自Sigma公司；兔抗Nrf2多克隆抗体及兔抗HO-1多克隆抗体购自Abcam公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物分组及DN模型制备 采用单肾切除后STZ干预制备DN模型。将小鼠采用6%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔麻醉后行右肾切除术，2周后切口完全愈合。将小鼠随机分为正常对照组、白藜芦醇对照组、模型组、白藜芦醇治疗组4组，每组10只。模型组及白藜芦醇治疗组小鼠按140 mg/kg腹腔注射STZ(溶于0.1 mol枸橼酸缓冲液中，pH为4.5)，72 h后尾尖取血测定血糖，以血糖≥16.7 mmol/L作为糖尿病模型成功的标志。正常对照组与白藜芦醇对照组注射等体积的枸橼酸缓冲液。

1.3 干预方法 DN造模成功后，将白藜芦醇溶于0.5%羧甲基纤维素制成混悬液，白藜芦醇对照组与白藜芦醇治疗组给予白藜芦醇5 mg/(kg·d)灌胃，正常对照组与模型组给予相同体积的羧甲基纤维素溶液灌胃，共干预8周。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.4 肾功能相关指标检测 造模成功后第8周，各组取6只小鼠，收集24 h尿液。股动脉取血，分离血清，用Olympus AU5400型自动生化分析仪检测肾功能相关指标，包括24 h尿蛋白定量(UP)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.5 肾组织氧化应激指标检测 取10%肾皮质匀浆100 μL，根据试剂说明书，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。取1%肾组织匀浆30 μL，采用黄嘌呤氧化酶法测定T-SOD活性。

1.6 肾组织Nrf2、HO-1蛋白表达检测

1.6.1 免疫组化染色法检测 切取肾脏，取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定，切片厚4 μm，常规脱蜡至水，高压修复，用SP三步法。一抗为兔抗Nrf2多克隆抗体(1∶200稀释)，兔抗HO-1多克隆抗体(1∶100稀释)，用PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，显微镜下观察并拍摄图像。

1.6.2 Western blotting法检测 取部分肾皮质组织，提取总蛋白及核蛋白，Bradford法进行蛋白定量。总蛋白上样量为100 μg，核蛋白上样量为50 μg，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，一抗封闭，Nrf2(1∶1 000)；HO-1(1∶2 000)，4 ℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶4 000稀释)，37 ℃孵育2 h，再次洗膜后ECL发光显影。以β-actin作为内参照，核蛋白以Histon-H1作为内参照。Western印迹条带信号强度应用Image J2X软件进行定量分析，测定各条带的灰度值。

2 结果

2.1 各组肾功能相关指标比较 与正常对照组比较，模型组UP、Scr、BUN均升高；与模型组比较，白藜芦醇治疗组UP、Scr、BUN均下降(P<0.01或0.05)。见表1。

表1 各组肾功能相关指标比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.05。

2.2 各组肾组织氧化应激指标比较 与正常对照组比较，模型组肾组织MDA含量增加、T-SOD活性降低(P均<0.01)；与模型组比较，白藜芦醇治疗组MDA含量降低、T-SOD活性升高(P均<0.05)。见表2。

表2 各组肾组织氧化应激指标比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.05。

2.3 肾组织Nrf2及HO-1蛋白表达比较 ①免疫组化染色结果：Nrf2蛋白表达定位于肾小球固有细胞及肾小管上皮细胞的细胞质和细胞核，呈棕黄色颗粒。在正常对照组及白藜芦醇对照组仅见少量表达，肾小管表达更明显。模型组Nrf2蛋白表达较正常对照组增强，白藜芦醇治疗组Nrf2蛋白表达较模型组进一步增加。HO-1蛋白主要定位于肾小球壁层上皮细胞和肾小管上皮细胞的细胞质中，模型组HO-1蛋白表达较正常对照组增强，白藜芦醇治疗组HO-1蛋白表达较模型组进一步增加。见图1、2。②Western blotting结果：模型组肾组织Nrf2总蛋白、核蛋白及HO-1蛋白表达均高于正常对照组，白藜芦醇治疗组Nrf2总蛋白、核蛋白及HO-1蛋白表达均高于模型组(P均<0.01)。见图3、4。

3 讨论

越来越多的研究证明，氧化应激是糖尿病及其并发症发生的一个重要机制。在氧化应激存在时，机体的抗氧化能力减弱，能清除活性氧簇(ROS)的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及过氧化氢酶(CAT)等的含量降低，导致ROS过度积聚。而过多的ROS能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化形成脂质过氧化产物如MDA，因此MDA可反映体内氧化应激水平，并间接反映组织细胞氧化损伤的程度[2]。本研究发现，与正常对照组比较，模型组UP、Scr、BUN均升高，肾组织匀浆MDA含量增加、T-SOD活性降低，提示DN小鼠肾组织损伤，且MDA含量升高及T-SOD活力下降，表明DN小鼠肾脏组织中存在明显的氧化应激。

注：A为正常对照组，B为白藜芦醇对照组，C为模型组，D为白藜芦醇治疗组。

注：A为正常对照组，B为白藜芦醇对照组，C为模型组，D为白藜芦醇治疗组。

图3 各组肾组织Nrf2及HO-1蛋白表达情况

注：与正常对照组比较，△P>0.05，#P<0.01；与模型组比较，*P<0.01。

当出现氧化应激损伤时，机体会形成一套复杂的氧化应激应答系统。研究发现，Nrf2和它的胞质接头蛋白Keap1是细胞抗氧化应激的中枢调节者。Nrf2是外源性有毒物质和氧化应激的感受器，正常情况下，Nrf2和细胞骨架相关蛋白Keap1结合成二聚体的形式存在于细胞质中，当受到外界氧化应激因子刺激后，Nrf2与Keap1解离并转位进入细胞核，然后通过与抗氧化应激反应元件ARE相互作用，诱导编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达[3]，如γ-谷氨酸合成酶(γ-GCS)、苯醌还原酶(NQO1)、谷胱甘肽S2转移酶(GST)、HO-1等[4]。Jiang等[5]研究发现，在DN患者的肾小球中存在氧化应激且Nrf2水平增高；动物研究证实，Nrf2-/-小鼠与Nrf2+/+小鼠相比可产生更多的ROS，且出现更为严重的DNA氧化损伤和肾脏损伤，表明Nrf2对STZ诱发的肾脏损害具有重要的保护作用。

Nrf2诱导的下游抗氧化酶HO-1是血红素降解反应的限速酶，能催化血红蛋白分子降解为等摩尔的胆绿素、CO和自由铁，而这些降解产物能通过减少氧化应激损伤、阻止细胞凋亡、对炎性反应的调节等发挥细胞保护作用[6,7]。Lee等[8]研究表明，HO-1在糖尿病状态下发挥重要的肾脏保护作用。另有研究发现，应用诱导剂氯化亚锡上调STZ诱导的糖尿病的自发性高血压大鼠HO-1的表达后，降低了肾皮质的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性和尿中8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷(8-OHdG)、硫代巴比妥酸反应物质的排泄[9]。这些结果表明，诱导HO-1的表达能减少肾脏的氧化应激反应。本研究发现，模型组Nrf2、HO-1蛋白表达均高于正常对照组，提示机体在出现氧化应激损伤时激发自身防御反应，通过激活Nrf2通路增加HO-1的表达，进而发挥抗氧化应激作用。

白藜芦醇是一种多酚类植物抗毒素，随着对白藜芦醇研究的深入，发现其具有抗氧化、保肝、 抗过敏、抗肿瘤、调节血脂、神经保护等多种生物学作用[10]。其对心血管疾病和肾脏疾病均有保护作用。Chang等[11]研究发现，白藜芦醇能降低DN时的血糖和血肌酐，减少氧化应激损伤，抑制促炎症细胞因子并上调腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)水平，这些可能均参与了对DN早期的保护作用。Ungvari等[12]研究发现，白藜芦醇可以激活冠状动脉内皮细胞Nrf2的转录活性，上调其目标基因如NADPH、HO-1等的表达，同时改善了高糖引起的氧化应激损伤，当用siRNA抑制Nrf2的表达时，白藜芦醇的保护作用是明显减弱的，提示白藜芦醇的保护作用很可能是通过激活Nrf2通路来实现的。本研究发现，白藜芦醇治疗组与模型组比较，MDA含量减少、T-SOD活性增加，同时Nrf2总蛋白与核蛋白及HO-1蛋白表达均增多，表明白藜芦醇能减轻DN小鼠肾脏的氧化应激损伤，而且可能是通过激活Nrf2通路来实现的。

综上所述，白藜芦醇对DN小鼠的肾组织具有保护作用，其机制可能是通过激活Nrf2通路、上调其下游的HO-1蛋白的表达，从而减少肾组织氧化应激损伤，进而保护肾脏功能。本研究为白藜芦醇应用于临床、延缓DN的进展提供了理论依据。