重瓣榆叶梅茎段组织培养体系的建立

张赫岩，叶冬梅，白玉娥，段国珍，彭 鹏，华佳文

（内蒙古农业大学 林学院，内蒙古 呼和浩特 010019）

重瓣榆叶梅Amygdalus trilobaf.multiplex，是蔷薇科Rosaceae 桃属Amygdalus的一种花灌木植物，具有开花早、花期长、花朵大、颜色鲜艳纯正等特点，是一种观赏价值很高的园林绿化树种[1]。其株高2 ～5 m，枝条开展，具多数短小枝；短枝上的叶常簇生，一年生枝上的叶互生；嫩枝上无毛或微有被毛；叶片呈宽卵形或倒卵形。重瓣榆叶梅开花早，花重瓣且较大，花期长，花色粉红，花型美丽，是北方地区早春观赏价值极高的园林绿化树种。重瓣榆叶梅的花枝细长，花型美丽，可以做插花供应材料，且现在拥有一定的市场；花粉营养成分丰富，含有蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素、微量元素、生物酶、黄酮类等化合物，可用于保健食品、药品以及营养性化妆品[1]。因此，重瓣榆叶梅是一种应用广泛、具有一定经济价值的园林绿化树种。

目前，重瓣榆叶梅在园林绿化中备受青睐，但因雌雄蕊退化，不能正常结实获得种子，很难满足生产需求[2]。榆叶梅的繁殖方法较多，如播种、扦插、分株、嫁接和组织培养繁殖等[3-4]。但常规扦插受到各种条件限制，成活率低；分株与嫁接繁殖系数低，速度慢，致使规模繁殖受限，远远不能满足市场的需求[5]。组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系数大的优点，不受繁殖材料和季节的限制，可在短时间内获得大量无性系[6-7]。冷肖荀等人[8]选择重瓣榆叶梅的茎尖进行组织培养，结果表明6-BA 1.0 mg/L 对榆叶梅的嫩芽分化效果显著。宋润刚等人[5]在研究重瓣榆叶梅组织培养过程中，以茎尖为外植体，在培养过程中可以使用抗生素类物质控制杂菌污染，并且可以提高芽的增殖和分化能力。不同部位外植体的取材对重瓣榆叶梅的组织培养影响较大，李凤飞[3]进行启动培养时，选择顶芽、腋芽、茎段3 种不同部位作为外植体，其中茎段的出芽率最高。但是在榆叶梅组织培养过程中，多数研究均存在接种外植体的褐化、接种萌芽率低等问题。因此，为解决重瓣榆叶梅繁殖系数低、接种萌芽率低和保持品种的优良特性，本试验采用组织培养对重瓣榆叶梅进行无性繁殖，以重瓣榆叶梅带腋芽的茎段作为试验材料，研究不同消毒方式、不同生长调节剂对重瓣榆叶梅诱导、增殖、生根的影响，以期为重瓣榆叶梅的快速繁殖提供参考依据。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

所用材料均采集于呼和浩特树木园内，采集时间为1—4月。树龄为3 ～5年生的重瓣榆叶梅当年生枝条或一年生枝条，剪去叶片及叶柄，截取带有一个腋芽的茎段作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒

将试验材料的叶片及叶柄全部剪去，使用洗洁精对带有腋芽的茎段进行清洗，重点刷洗重瓣榆叶梅的腋芽部位。将刷洗好的茎段装进烧杯，流水冲洗30 min。于超净工作台中用75%酒精处理30 s，无菌水冲洗3 次，然后分别以0.1%升汞溶液（处理6、8、10、12、14 min）、2%次氯酸钠溶液（处理6、8、10、12、14 min）进行消毒，最后使用无菌水冲洗5 次。接种于以MS 为基本培养基、添加IBA 0.5 mg/L 的培养基中，培养条件为温度25 ℃，光照强度2 000 lx ，光照14 h/d，pH值5.8 ～5.9。接种后5 d 开始统计外植体感染及存活情况。

1.2.2 初代培养

在无菌滤纸上将消毒好的茎段切去与消毒液接触的两端，再将茎段切成带有一个腋芽的小段，接种于分别以MS、WPM 为基本培养基，添加蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L，不同质量浓度的6-BA（1.0 ～2.0 mg/L）、NAA（0.05 ～0.20 mg/L）的培养基中。培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx，光照14 h/d，pH 值5.8 ～5.9。接种后30 d 观察并统计丛生芽的生长情况。

1.2.3 继代增殖

以初代培养的重瓣榆叶梅丛生芽为外植体进行增殖，以MS 为基础培养基，添加蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L 以及不同质量浓度的6-BA（1.0 ～2.0 mg/L）、NAA（0.1 ～0.5 mg/L）、KT（0 ～1.0 mg/L）。培养条件与初代培养一致，30 d 后统计幼苗的增殖情况及生长状况。

1.2.4 生根培养

以增殖培养得到的无菌苗为材料进行生根培养，在1/2MS 培养基中，添加蔗糖20 g/L、琼脂5.5 g/L，附加不同质量浓度的NAA（0.1 ～0.3 mg/L）和IBA（0.1 ～0.3 mg/L）。培养条件：温度25 ℃，光照强度2 000 lx ，光照14 h/d，pH值5.7 ～5.8。20 d 后统计幼苗的生根和生长状况。

1.2.5 数据统计

本试验所有数据均采用Excel 软件进行统计，SPSS 19.0 软件进行结果分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对重瓣榆叶梅茎段消毒的影响

不同消毒方法对重瓣榆叶梅茎段消毒的影响见表1。

表1 不同消毒方法和时间对茎段外植体灭菌的影响†Table1 Effects of different disinfection ways and time on sterilization of stem segment explants

试验结果表明，0.1%升汞和2%次氯酸钠都具有一定的茎段表面灭菌效果，在一定范围内感染率会随着时间的增长而降低，存活率随着时间的增长而降低。因此在筛选最佳消毒时间时，可以综合这两种消毒方法考虑。使用0.1%升汞对茎段进行消毒8 min 时，感染率较低，为13.30%，存活率较高，为76.7%；在14 min 时虽然感染率已经为零，但存活率较低，说明消毒时间过长会将植物细胞杀死，影响茎段生长，所以在使用0.1%升汞进行消毒时，8 min 为最佳消毒时间，效果最好。同理，使用2%次氯酸钠消毒12 min 时，感染率较低，存活率较高，所以在使用2%次氯酸钠进行消毒时，12 min 为最佳消毒时间。重瓣榆叶梅茎段的最佳消毒方案为：75%酒精处理30 s，然后使用0.1%升汞处理8 min 或使用2%次氯酸钠处理12 min。图1和图2分别为茎段初代培养的生长情况。

2.2 不同激素种类与质量浓度配比对诱导芽萌发的影响

重瓣榆叶梅茎段接种后，放至培养箱进行培养，定期观察侧芽生长状况，40 d 后统计生长情况。

在比较MS 培养基和WPM 培养基对茎段启动培养的影响时发现，从启动率、生长状况两方面观察，同种质量浓度下使用MS 培养基比WPM 培养基诱导率高，生长状况好，所以重瓣榆叶梅茎段启动培养的最适基本培养基为MS培养基（表2）。对照组C7 的茎段诱导率低于其他处理，说明添加适宜的外源激素对茎段启动培养有一定作用；当添加6-BA 2.0 mg/L+0.05 mg/L NAA 时，诱导率最高，达89.30%，且生长状况良好，利于继代增殖。因此，对于重瓣榆叶梅茎段诱导芽萌发的启动培养，最适培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L。

图1 茎段初代培养生长良好Fig.1 Stem segments growing well in initial culture

图2 茎段初代培养生长较差Fig.2 Stem segments growing poorer in initial culture

表2 不同激素配比对茎段芽诱导的影响†Table2 Effects of different hormone combinations on induction of axillary bud stem segments

2.3 继代增殖培养

如表3所示，不同激素质量浓度配比对重瓣榆叶梅增殖培养效果不同。添加 KT 1.0 mg/L，其增殖率升高，丛生芽长势更健康，叶片呈翠绿色。平均株高以及增殖率情况比较好的处理是E1、E2、E7、E8，说明低质量浓度的NAA 可以促进丛生芽增殖及生长，质量浓度过高会对组培苗产生抑制作用（图3、图4）。综合平均株高与增殖率来看，在增殖阶段最适增殖培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ KT 1.0 mg/L。

表3 不同激素配比对丛生芽增殖的影响†Table3 Effects of different hormone combinations on proliferation of axillary bud

图3 增殖培养生长状况较好Fig.3 Proliferation culture growing well

2.4 诱导生根

将增殖培养得到的幼苗接种在1/2MS 培养基中诱导根系，结果如表4所示。试验结果表明，添加适宜的激素可以促进组培苗生根，生根率随着IBA 和NAA 质量浓度的增加而增加，但到达一定程度后生根率会随着激素质量浓度增加而减小。经过30 d 的培养，生根数目为1 ～4 条，根长为2 ～5 cm（图5）。综合平均根数、平均根长、生根率3 个指标来看，诱导生根最佳处理是F2，即1/2MS + IBA 0.2 mg/L。

图4 增殖培养生长状况较差Fig.4 Proliferation culture growing poor

3 讨 论

外植体消毒是植物组织培养的重要环节之一，获得无菌且具有生长活性的外植体是组织培养取得成功的重要因素[9]。在试验过程中使外植体不经愈伤组织脱分化培养阶段，而直接诱导分化苗，省去了诱导愈伤组织这一步，简化了技术程序，缩短了培养时间，同时经这种途径培育出的苗木能稳定地保持母体的优良遗传特性[10]。通过对外植体的消毒，杀死外植体表面微生物，但是要保证尽可能减少外植体表面细胞的伤害，它的成功与否直接影响后续环节[11]。本研究发现，外植体的选择对重瓣榆叶梅的污染率以及死亡率有一定影响，茎段较嫩在消毒时容易死亡，且腋芽生长缓慢矮小；选取半木质化的茎段，死亡率降低，且腋芽生长状况良好，易于后期继代增殖，这与吴玲利等[9]在白木通Akebia trifoliatavar.australis组织培养及快速繁殖的研究相一致。因此在采集外植体时最好不要选择当年生幼枝，选取半木质化的茎段进行组织培养较好。

表4 不同处理对生根培养的影响†Table4 Effects of different treatments on rooting culture percentage

图5 芽在生根培养基中生长Fig.5 Buds growing in the rooting medium

激素的种类与质量浓度对植物的生长发育起着至为关键的作用[12]。在进行重瓣榆叶梅组织培养时，高质量浓度的激素可促进组培苗的增殖，但抑制了生长。当NAA 质量浓度较高时，重瓣榆叶梅的生长状况较差，植株矮小且叶片小，反而较低质量浓度的NAA 会促进丛生芽增殖，长出的新芽体积变大。KT 的有无对丛生芽增殖有很好的促进作用，添加了KT，丛生芽明显比没有加KT 的丛生芽增殖得多，体积更大。低质量浓度的6-BA 促进重瓣榆叶梅继代增殖，这与冼康华等[13]对文采唇柱苣苔Chirita wentsaiiD.Fang et L.Zeng的研究结果相似。

在生根培养时，芽基部生长出大小不均的颗粒状愈伤组织，在此基础上生长出根，属于愈伤型生根。重瓣榆叶梅适宜在生长素质量浓度较低的条件生根，当IBA 或NAA 质量浓度超过0.2 mg/L时会抑制生根。

使用IBA 诱导生根的效果比NAA 更好，生根数目多，根系长，生根率高，这与孟永红等[14]在楸树Catalpa bungei植株再生体系研究中的结果一致。

4 结 论

本研究发现，在进行重瓣榆叶梅茎段组织培养时，外植体消毒先用75% 酒精处理30 s，然后用0.1% 升汞溶液消毒8 min 或2% 次氯酸钠溶液消毒12 min，效果最好，茎段感染率较低，存活率高；在选择初代培养基时，以MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L 为基本培养基，诱导率可达89.30%；增殖培养基以MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L + KT 1.0 mg/L 为最佳，增殖倍数为4.4，且生长状况良好；最佳生根培养基为1/2MS + IBA 0.2 mg/L。