人体运动疲劳前后尿液的代谢组学研究

王福秋 张 燕

(北京化工大学 文法学院，北京 100029)

疲劳从1880年Mosso首次被发现已有100多年的历史，但围绕运动疲劳(Exercise-induced Fatigue)产生机制及诊断方法进行的相关研究一直在继续[1]。代谢组学是研究机体代谢产物谱变化的一种新的系统方法，它作为后基因时代的新兴组学与基因组学、转录组学、蛋白组学共同构成了系统生物学，通过对生物信息的化学分析和处理，使人们能够从分子水平研究生命现象、探讨生命本质、逐步系统地认识生命发展规律[6]。代谢组学通过血浆或尿液代谢产物的整体模式或指纹分析，比单一靶标具有更好的一致性和预见性[7]，可能对建立运动疲劳的客观诊断方法提出新的思路。北京师范大学运动人体科学实验室从2001年开始采用神经生物学、电生理学、生命分析化学和运动生理学等方法对运动疲劳的中枢机制展开了一系列研究，从神经元电活动、递质和受体表达、能量代谢等方面，多角度阐明了黑质—纹状体神经通路对运动疲劳产生的中枢调控作用及其机制[2-5]，对开发研制延缓疲劳产生和加速疲劳消除的分子靶向药物，寻找运动疲劳的有效诊断方法具有重要意义。本课题在前期研究成果基础上采用基于代谢组学的核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和模式识别(pattern recognition analysis, PRA)技术，对人体在一次性力竭运动前后尿液的代谢图谱进行分析，初步揭示代谢产物变化与运动疲劳的关系，以期为代谢组学在运动人体科学研究中的应用开辟一条新途径。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象与分组

选取北京师范大学体育与运动学院36名男生作为受试者，年龄在18-22岁之间，平均身高175.17±5.55cm，体重68.66±5.18kg，身体健康，运动水平均达2级以上。实验前一个月内未服用任何药物，实验前一天和实验当天统一控制受试者饮食。

1.2 主要仪器与试剂

德国Cortex Metalyzer 3B运动心肺功能系统、荷兰Lode Valiant跑台、日本Arkray自动尿液分析仪、德国Eppendorf Centrifuge 5417R冷冻离心机、德国Crist冷冻干燥机、美国Revco超低温冷冻风冷式冷凝器、瑞士Bruker Avance DRX 500型超导核磁谱仪、重水(deuterium oxide/D2O, 美国 Noreu 公司)、2,2,3,3,三甲基甲硅烷基丙酸(3-trimethylsilyl-[2,2,3,3-D4]-propionate/TSP, 美国 CIL公司)、磷酸缓冲溶液(PBS, 北京化工厂)等。

1.3 运动负荷方案

依据田野[8]等人的运动方案，根据运动时耗氧量占最大摄氧量的百分比控制运动强度，采用一次性多级递增负荷跑台运动方式建立人体运动疲劳模型。测试要求：受试者进入实验室静坐30min，测定安静时心率；在跑台上以5000m/h的速度慢跑3min作为准备活动；递增跑台运动开始的起始速度为8000m/h，坡度为0 %；每2min增加2.5%的坡度递增运动强度，速度不变；受试者连续运动至力竭，经过反复鼓励仍不能坚持为止；恢复阶段在无负荷状态下继续运动2min。测试期间用Polar心率表监测受试者运动过程中的心率。测试前24h内要求受试者不参加剧烈的体力活动，禁止吸烟，测试在餐后2～3h后进行。

1.4 尿液样品的收集与处理

收集受试者运动前清晨、运动疲劳后第一次的中段尿液，分别装入采样盒内，取1ml尿液进行超低温冷冻干燥处理，-20℃保存待用。核磁共振信号采集前，样品4°C，13000×g离心10min，取上清液以2: 1加入磷酸盐D2O缓冲溶液(0.2mol?L-1 Na2HPO4/0.2 mol?L-1NaH2PO4，pH 7.4)，静置10min，再于4°C，13000×g离心10min，取上清液0.55mL加入适量的D2O和TSP置于5mm核磁管中进行NMR测试。另取少量运动前、后尿液用于尿十项生化指标检测。

1.5 NMR数据采集和处理

在AVANCE DRX 500型NMR仪上调用noesypr1d脉冲序列，采用预饱和方式压制水峰，脉冲功率50dB，脉冲宽度12.4?s，射频脉冲-1dB，混合时间0.8s，增益640，延迟时间为2s。采样次数128次，控制温度300±0.1K。自由感应衰减(free induction decay，FID)信号经过傅立叶变换转为1H-NMR谱图。尿液样品1H-NMR谱图以TSP为化学位移参考峰的位置，将调整相位和基线后的氢谱δ0.2～9.8区域进行分段积分，每段0.04ppm(500M谱仪上对应于20Hz)，将谱图划分成若干区域。为了避开溶剂峰压制对谱图造成的影响，水峰附近的区域(δ4.4～5.0)被去除。将积分数据归一化后以Excel文件储存，用于随后的主成分分析(principal components analysis, PCA)。

1.6 数据分析

将积分值进行中心化和比例换算，求出主成分(principal components , PC)，利用PC对运动前后尿液进行代谢组学分析。根据一定规律和比照检测不同状态下代谢表达谱的变化，从复杂的1H- NMR波谱数据中寻找导致运动员疲劳代谢改变的作用位点及相关生物标志物。采用SPSS 13.0统计软件包对数据资料进行统计分析，结果均以mean±SD表示。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)所得数据，选择LSD比较各组间差异，P<0.05表示显著性差异。

2 研究结果

2.1 人体运动疲劳状态的评价

36名受试者平均运动至力竭时间20.72±1.87min，运动前平均心率为67.41±7.80次/min， 运动后平均心率为195.53±7.72次/min，最高心率为220±7.72次/min，说明受试者均达到极限负荷心率。对受试者运动疲劳后的尿样进行尿十项检测，结果见表1。从表1结果显示，受试者运动疲劳后的尿样中出现尿蛋白的阳性率为80.6%，尿潜血的阳性率为25%，还有少数运动员出现尿糖、尿酮体和尿比重增加等记录，说明受试者处于运动疲劳状态。

表1 受试者运动疲劳后尿样检测结果一览表

2.2 运动疲劳前后尿样1H-NMR扫描典型图谱

受试者运动疲劳前后1H-NMR典型图谱如图1、2所示。通过对同一受试者运动疲劳前后1H-NMR图谱的对比分析，发现与运动疲劳后尿样1H-NMR图谱峰出现了明显的变化。主要特征为：谱峰在1.4ppm、2.7ppm、3.5ppm、4.0ppm、5.5ppm和8.5ppm处均较运动前安静状态有明显升高，分别用序号1～6表示。

A: 安静状态；B: 疲劳状态图1 典型受试者在运动疲劳前后1H-NMR图谱比较

图2 典型受试者在运动疲劳后1H-NMR图谱变化特征

2.3 主成分分析结果

对受试者运动疲劳前后尿样进行PCA分析，结果用得分散点图(score plot)和因子载荷图(loading plot)表示(图3、4)。由图3、4可见，运动前与疲劳后的主成分积分值分别分布在椭圆型散点图(95%置信区间内)的左右侧两个区域内，无交叉与重叠。而且在1.3403ppm、1.3804 ppm、3.1005 ppm、4.1399 ppm和4.18 ppm处的散点出现明显偏移。

L: 安静状态; R: 疲劳状态图3 受试者运动疲劳前后尿样 PCA 分析的散点分布图

图4 受试者运动疲劳前后尿样PCA分析的因子载荷图

3 分析与讨论

本实验采用一次性递增负荷的跑台运动方式建立了人体运动疲劳模型。通过生理生化指标检测表明，受试者平均运动至力竭的时间为20.72±1.87min；运动前平均心率为67.41±7.80次/min，运动后平均心率为195.53±7.72次/min，最高心率为220±7.72次/min，均已达到极限负荷心率。受试者运动疲劳后出现尿蛋白的阳性率为80.6%，尿潜血的阳性率为25%，还有少数运动员出现尿糖、尿酮体和尿比重增加等现象，上述结果说明受试者运动后均已达到运动疲劳状态[9]。

将实验前后采集的尿液进行1H-NMR检测和PCA进行分析，进而检测由于运动训练量和强度变化而引起代谢物的变化。进行高通量的代谢组学分析后，运动员尿液样本的动态代谢的轮廓都被记录下来。运动疲劳后与安静时的尿液在积分散点图中呈聚类型分布，两组间未见重叠，反映运动员的身体机能状态的变化。运动前安静时的尿样集中分布在左侧，而疲劳后的尿样集中分布在右侧，完全将受试者运动前与疲劳后的尿样进行明显区分，说明尿液的代谢组学分析可以较好的反应运动前后机体代谢特征的变化。尿液中的主要代谢物，包括TMAO、牛磺酸和马尿酸的浓度在运动疲劳后是较高的。通过分析由于疲劳前后运动强度与量不同而引起的代谢物的差异，并且在代谢通路上找出代谢物彼此之间的联系。在运动科学研究中三羧酸循环被认为是关于能量代谢的重要通路。随着训练强度的变化而引起了相关代谢物发生变化，这表明不同训练强度和训练量影响着TCA循环。通过loading图显示，在1.3403ppm、1.3804 ppm、3.1005 ppm、4.1399 ppm和4.18 ppm处的物质对图谱的影响最大。进一步分析确定这些物质的种类将有助于寻找运动疲劳的标志物并判断疲劳产生的潜在原因。

运动性疲劳是指人体长时间大强度运动后出现的一种组织器官甚至整个机体的工作能力暂时性降低的现象。疲劳的产生与运动导致体内代谢产物积累、能量物质耗竭、基质生化状态改变等代谢调节功能失调有关[10]。近年来，随着竞技运动水平的不断提高和比赛的日趋激烈，运动员在训练和比赛中承受的运动负荷越来越大，对机体极限的挑战越来越高。因此，有关运动疲劳的产生机制和疲劳的早期诊断方法等一系列问题早已成为国内外运动医学研究领域关注的热点。然而，以往的一些研究均依据运动员血样或尿样中不同物质含量的变化作为判断运动疲劳程度的生化指标，由于指标选择有限且个体差异因素难以剔除等不足大大降低了疲劳判断的准确性。代谢组学主要研究生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化规律，并通过生物体液的代谢物分析来反映机体系统的生理和病理状态[11]。1H-NMR作为当前代谢组学研究中的主要技术之一，可实现对样品非破坏性、非选择性的分析, 尽可能地保留和反映总的代谢产物的信息，具有简单、无创、灵敏性高的特点，已开始应用于临床药物筛选和疾病诊断[12-15]。本研究直接选取运动员作为实验对象，对运动员运动疲劳后尿液的变化进行了代谢组的初步探索性研究，研究结果将为运动疲劳的早期诊断提供新思路，开辟新途径。

4 小结

本研究通过对人体运动疲劳前后尿液的1H-NMR检测与分析发现，运动疲劳前后的尿液在积分散点图中呈聚类型分布，两组间未见重叠，且运动疲劳后尿样1H-NMR图谱峰较运动前出现了明显的变化。本研究结果初步证明，人体尿液的代谢组学分析可更客观地反应运动疲劳前后体内代谢的变化特征，有助于寻找运动疲劳的代谢标志物，也可作为简单、无创、灵敏性高的运动疲劳早期诊断方法。但人体代谢通路的复杂性及各个通路之间的相互扰动，及分析方法的可靠性等还存在很多问题，在运用代谢组学研究运动疲劳的相关机制还有很远的路要走。