龙葵碱调控p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表达抑制卵巢癌细胞增殖实验研究*

朱军义， 马繁华 ，徐亚辉

1.河南省南阳市中心医院 (南阳473000);2.河南省人民医院(郑州大学人民医院)妇产科 (郑州450003)

卵巢癌是一种恶性肿瘤，严重危害女性生殖器官，造成卵巢癌死亡的原因是癌细胞发生迁移，一旦发病，患者病死率极高，影响着女性的身体健康和心理健康[1]。龙葵碱(茄碱)主要存在于茄科植物中，例如马铃薯的块茎以及龙葵全身，其中马铃薯芽中含量最高，毒性也最强[2]。AKT是一种临床上较为常见的丝/苏氨酸蛋白激酶,P-AKT则是磷酸化的AKT，又称磷酸化蛋白激酶B(PKB)[3]。Cleaved Caspase-3为天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡的早期阶段发挥着关键性的作用。P53是一种至今为止发现的与肿瘤发生相关性最高的抑癌基因。本文主要研究不同浓度的龙葵碱进行调控p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表达抑制卵巢癌细胞增殖诱导及其凋亡。

材料与方法

1 材 料

1.1 研究细胞：实验所用的正常卵巢细胞、SKOV3卵巢癌细胞系购买自American Type Culture Collection(ATCC)。本文研究均获得我院伦理委员会批准。

主要试剂及药物：磷酸盐缓冲液(PBS)(天根生化科技有限公司)；DMSO溶液(上海国药集团化学试剂有限公司)。MTT试剂盒(钟鼎生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(由美国赛默飞世尔科技有限公司提供)；鼠抗人p-AKT、Cleaved caspase-3和p53单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)；龙葵碱和胎牛血清(武汉博士德生物工程有限公司提供)。

1.2 主要仪器：倒置荧光显微镜和流式细胞仪(均由美国贝克曼库尔特公司提供)。

2 实验方法

2.1 细胞处理及分组：在超净工作台中配制细胞所用的培养基，其中胎牛血清的比例可控制在10～15%，双抗(青霉素链霉素)的比例一般在1%左右，例：500 ml的RPMI-1640培养基，需要加入胎牛血清56 ml和100×的双抗5.56 ml。细胞用PBS：Nacl 4 g+Kcl 0.1 g+Na2HPO4×12H2O 0.71 g+KH2PO40.135 g用ddH2O定容至500 ml。方法实验分为模型对照组和龙葵碱处理组，种板后24 h换无血清培液时加入龙葵碱预处理24 h，细胞饥饿24 h后，更换无血清培液，再每天加入龙葵碱，48 h后提取细胞蛋白。共5孔，分别为正常对照孔(加入1 μl的PBS溶液和 1 μl的DMSO)、模型对照孔、龙葵碱15 μmol/L、龙葵碱10 μmol/L、龙葵碱5 μmol/L，分为正常对照组、模型对照组、龙葵碱15 μmol/L组、龙葵碱10 μmol/L组、龙葵碱5 μmol/L组。

2.2 倒置显微镜观察SKOV3卵巢癌细胞形态：将SKOV3卵巢癌细胞传代到6孔板中，加入25%的胰蛋白酶，消化5 min后，用离心机以2000 r/min的速度离心5 min后取上清液，用37 ℃的PBS缓冲液洗涤3 min，重复两次后，再次用离心机以2000r/min的速度离心5 min后取上清液，接着加入浓度为95%的4 ℃乙醇，放置15 min，用离心机以1000 r/min的转速分离，去除上清液，PBS重悬细胞，将细胞密度调至为0.5～2.0×106/ml，去除细胞悬液后加入2 μl的Hoechst33258染液进行染色10 min，最后置于载玻片上，加上盖玻片，采用荧光显微镜对细胞的形态进行详细观察。

2.3 MTT检测增殖能力：将进行培养后的细胞制成细胞悬液，然后接种于96孔的培养板中，在每一个孔均加入细胞悬液90 μl，将三个不同浓度龙葵碱的培养细胞组的观察时间定位24 h、48 h和72 h，每1个细胞组分别设置5个复孔，将不同浓度的龙葵碱分别加入每个细胞培养组中。参照组细胞在每孔中加入10 μl的培养液，然后按照三个不同浓度的龙葵碱细胞组的时间进行细胞培养。待所有细胞组培养到相应的时间后，在每孔中加入MTT 20 μl继续孵育4 h，将孔上的上清液仔细吸取，然后在孔中加入150 μl的DMSO，振荡10 s，采用酶标仪测定波长为570 mm的细胞组OD值，按照肿瘤细胞增殖率计算公式，增殖率%=(细胞组OD值/参照值-1)×100%，对HGC-27的细胞增殖率进行计算。

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡：将五组细胞传代到5孔板中，置于温度为37 ℃，浓度为5%的二氧化碳的饱和湿度环境下培养24 h、48 h和72 h，加入浓度为0.25 %的胰蛋白酶进行消化，用离心机以2000 r/min的转速离心5 min后收取细胞，然后使用PBS缓冲液洗涤3 min，重复洗涤2次，再次用离心机以2000 r/min的转速分离后收集细胞，加入1MlPI染液，在避光的常温环境中放置1 h后，然后用特异荧光标记后，在鞘液包裹下高速流动中，流动期间会发射出光子，严格按照流式细胞仪检测，利用发光信号测量仪检测光子数值，到达检测细胞凋亡的目的。

2.5 Western Blotting检测p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表达：将采集到的细胞，使用PBS缓冲液清洗3遍以上，分离缓冲液，加入IP细胞裂解液，进行裂解35 min，将双蒸水浸泡过的细胞置于EP管中保存，温度为5 ℃，使用转速为1000 r/min的离心机，离心处理20 min，分离上层血清，提取血浆，在-80 ℃环境中保存，待用。通过SDS-PAGE凝胶进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min；100V,电泳10 min，结束之后，将电转膜浸泡在10%的牛奶中，在37 ℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST稀释按(1∶1000)稀释一抗，在4 ℃的环境下孵育过夜保存；第2天用TBST缓冲液清洗，与二抗结合在室温下孵育1 h，再次用TBST缓冲液清洗反复清洗。最后将其仅在底物溶液中进行显色，采用BCA法测定蛋白浓度，严格按照BCA蛋白定量试剂盒操作说明书进行，分析灰度值，目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值=目的蛋白相对表达量。

结 果

1 倒置显微镜观察SKOV3卵巢癌细胞增殖能力变化 正常对照组细胞饱满完整，大小均匀，排列紧密。卵巢癌细胞形态完整，轮廓清晰，细胞的大小一致，细胞浆饱满，具有较强的遮光性，细胞贴壁良好，增殖性强；龙葵碱组细胞体积减小，轮廓不清晰，细胞皱缩，具有较差的遮光性，细胞易脱落，贴壁不好，悬浮的细胞增多(图1)。正常对照组细胞和核模型对照组细胞细胞核大小保持一致，分布均匀；龙葵碱组细胞核固缩，核边集和凋亡小体形成。随着龙葵碱的浓度越高，细胞凋亡的形态学表现越明显(图2)。

图1 MTT增殖实验卵巢癌细胞增殖能力的变化(Hoechst33258染色，×200)

图2 不同浓度的龙葵碱作用于卵巢癌细胞染色后细胞核的形态学变化(Hoechst33258染色，×200)

2 五组细胞在不同时间段细胞凋亡率及细胞增殖率比较 如表1所示，龙葵碱5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L组在24 h、48 h、72 h时间段对SKOV3卵巢癌细胞凋亡率及细胞增殖率模型对照组相比较，SKOV3卵巢癌细胞凋亡率逐渐升高，增殖率逐渐降低，正常对照组的细胞凋亡率和细胞增值率显著低于其他各组，具有统计学差异(P<0.05)。随着时间的延长和药物浓度的提高SKOV3卵巢癌细胞的生长抑制作用越来越显著，与模型对照组相比，具有统计学意义(P<0.05)。

3 五组细胞p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表达 如表2所示，模型对照组p-AKT、Cleaved caspase-3的表达显著低于龙葵碱5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L组，正常对照组低于模型对照组，龙葵组p53蛋白显著高于模型对照组，正常对照组p53蛋白低于卵巢癌组，差异有统计学意义(P<0.05)。龙葵碱5 μmol/L p-AKT、Cleaved caspase-3的表达显著低于龙葵碱10 μmol/L、15 μmol/L组，p53蛋白表达高于其他两组浓度，随着龙葵碱浓度的升高，p-AKT、Cleaved caspase-3表达逐渐升高，p53蛋白表达逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组细胞在不同时间内的细胞凋亡率及细胞增殖率比较

注:与正常对照组相比，△P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05

表2 各组细胞p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白表达

注:与正常对照组相比，△P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05

讨 论

卵巢癌是女性生殖器官最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌排名第二位，严重的威胁着患者的生命安全[4]。早期卵巢癌无明显症状表现，具有一定的隐匿性，缺乏特异性症状，当诊断发现时，大多数患者已处于中晚期,错过了临床治疗或手术的最佳时间，大约有80%以上的卵巢癌患者经诊断发现病情时已经出现了局部的蔓延，致使其死亡率一直高居妇科恶性肿瘤之首[5]。卵巢癌患者5年生存率仅为30%左右，远远低于人体其他恶性肿瘤患者的5年生存率，如果能及早发现并接受治疗，其5年生存率可能会达到90%左右，这也体现出了对卵巢癌症状早发现早治疗的重要意义[6-7]。

肿瘤的恶性程度主要受其分化程度、病理类型的影响，在卵巢癌的不同时期，患者血清中的多种因子有着不同的分化水平，虽然卵巢癌缺乏特异性症状，但是通过检测血清中的多种因子，可以对患者是否患有卵巢癌提供重要的临床参考依据，以便使患者及早得到治疗[8]。AKT是一种临床上较为常见的丝/苏氨酸蛋白激酶,P-AKT则是磷酸化的AKT，P-AKT具有一定的生物学活性,因为其蛋白产物与蛋白激酶A、蛋白激酶C具有高度的同源性,所以临床上又称之为蛋白激酶B(PKB)[9-10]。P-AKT能够通过对人体各种下游分子产生作用,从而调控细胞周期,促进细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,进而对肿瘤的生物学进展产生影响[11]。本文研究结果显示，在龙葵碱的作用下，SKOV3卵巢癌细胞中P-AKT的表达水平呈现出了上升趋势，说明龙葵碱能够调控卵巢癌细胞中的P-AKT表达水平，从而抑制SKOV3卵巢癌的增殖能力，诱导其凋亡。

细胞凋亡的主要表现是DNA的裂解，染色质发生浓缩，细胞膜被活化，细胞发生皱缩，导致凋亡小体的形成。Caspase引起细胞凋亡的变化过程现在不太明确，相关机制有三种：凋亡抑制物，破坏细胞结构，调节蛋白功能。Caspase是一组以天冬氨酸为底物的半胱氨酸蛋白酶家族，Caspase家族中大多数的成员在细胞凋亡的过程中发挥着重要的作用，Caspase家族基因的高表达能够诱发细胞的凋亡，Caspase-3是该家族的核心成员[12]。Caspase-3为天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶，由酶原经过酶解作用产生，在细胞凋亡的早期阶段发挥着关键性的作用，所以临床上被称为死亡蛋白酶，是目前为止已知的细胞凋亡的最后执行因子[13]。有学者研究表明[14-15]，Caspase-3通常以Pro-Caspase形式存在，而Pro-Caspase是无活性的Caspase-3前体，当人体细胞受到凋亡信号或者其他外界有害物质的刺激时，Pro-Caspase会进一步转变为有活性的Caspase-3，即常说的裂解的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)，Cleaved Caspase-3具有成熟酶的性质，通过酶切割特异性底物、DNA依赖性蛋白激酶、actin、lamin等参与细胞的凋亡过程，所以，临床上常把Caspase-3的激活与否作为判断细胞凋亡情况的重要指标之一。如果Caspase-3蛋白的激活表达受到抑制，则细胞凋亡的情况会明显得到减轻。Wang XM[16]等在其研究结论中表明，Cleaved Caspase-3在正常卵巢组织、卵巢癌组织中的阳性表达率呈明显下降趋势，说明Cleaved Caspase-3在正常人体组织中的高表达能够诱导肿瘤细胞凋亡，从而使细胞数量保持稳定水平；但是Cleaved Caspase-3在肿瘤组织中的低表达，会使细胞增殖速度加快，细胞凋亡相对减少，从而促使卵巢癌的发病。本文研究结果显示，在龙葵碱的作用下，SKOV3卵巢癌细胞中Cleaved caspase-3的表达水平呈现出了上升趋势，说明龙葵碱能够调控卵巢癌细胞中Cleaved caspase-3的表达水平，从而促进SKOV3卵巢癌细胞的凋亡，进而达到治疗卵巢癌的目的。

P53是一种至今为止发现的与肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，其分为野生型和突变型两种[17]。野生型P53蛋白能够参与细胞周期的调节，可以有效抑制DNA的合成和复制，从而抑制细胞的增殖，而突变型的P53蛋白对DNA亲和力下降，抑制细胞能力呈现出减弱的趋势，从而失去了抗癌活性[18]。本文研究结果显示，在龙葵碱的作用下，SKOV3卵巢癌细胞中p53蛋白的表达水平出现明显的下降，说明龙葵碱能够降低P53蛋白的表达水平，使P53蛋白恢复抗癌活性，从而达到治疗卵巢癌的目的。

综上所述，龙葵碱可能通过调控p-AKT、Cleaved caspase-3和p53蛋白的表达而抑制SKOV3卵巢癌的增殖能力，诱导其凋亡，其能力呈现浓度依赖。