茵陈蒿汤对急性肝内胆汁淤积大鼠肠道黏膜屏障和NF-κB的影响*

李京涛,焦俊喆,魏海梁,闫曙光,李日向,常占杰,郭英君

1.陕西中医药大学附属医院 (咸阳 712046)；2.陕西中医药大学 (咸阳 712046)；3.宁夏回族自治区人民医院 (银川 750001)

急性肝内胆汁淤积属于临床难治的一类疾病，发病机制与肝细胞和(或)毛细胆管胆汁分泌障碍或肝内胆管梗阻有关[1]。而新近研究发现，急性肝内胆汁淤积发生发展与肠黏膜屏障的破坏明显相关[2-4]。茵陈蒿汤是临床上治疗急性肝内胆汁淤积的经典方药，此方可明显改善肝病高黄疸患者肝功能、促进胆红素代谢及缓解消化道不适症状[5-7]，但是否具有保护肠道黏膜屏障的作用，尚不清楚。本研究制备急性肝内胆汁淤积SD大鼠模型，观察茵陈蒿汤对大鼠肠道黏膜屏障及肝组织NF-κB表达的影响，从而探讨茵陈蒿汤对肠道黏膜屏障保护机制，为中医药治疗急性肝内胆汁淤积提供实验依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物: 健康幼年雄性清洁级SD大鼠70只，日龄21 d，体重(80±20)g，由西安交通大学实验动物中心提供，饲料隔日更换1次，自由摄取食水，环境室温(22±1)℃，相对湿度40%～60%。

1.2 药物制备:茵陈蒿汤方药均由陕西中医药大学附属医院药剂科统一购买和制备成冻干粉，符合中国药典(2015版)要求，每克含生药8 g，冻干粉密封保存于4 ℃ 冰箱内备用，使用时100 ℃水溶解，使用时配置为剂量为1 g/ml的药液。

1.3 主要试剂与仪器:ANIT(美国Sigma)；NF-κB ELISA试剂盒(南京森贝伽)；苏木素、伊红(陕西博达)；图像采集系统：NIKON．ACT-1DXM1200日本尼康公司；光学显微镜：蔡司光学仪器(上海)公司；病理组织切片机(湖北泰维)，型号：TB-718EL。

2 实验方法

2.1 实验分组:70 只大鼠按照体重随机分为正常空白组(10 只)，模型组(30 只)、中药组(30 只)，其中中药组和模型组又按灌服ANIT 后24 h、48 h、72 h 3个时间点分为3 组，每组10 只。

2.2 造模和给药: 各组幼鼠分笼饲养，适应性喂养3 d。造模方法：按50 mg/kg给予幼鼠一次性灌服1 % ANIT溶液，空白组按50 mg/kg灌服麻油，所有组灌胃前后12 h只进水不进食。造模前3 d予中药组灌服茵陈蒿汤液(每次4 ml/kg，2次/d)至实验结束，空白组和模型组每天同时灌服等量生理盐水。造模后分24 h、48 h和72 h三个时间点处死幼鼠，空白组于48 h时间点全部处死。

2.3 标本采集:各组幼鼠腹腔注射6 %水合氯醛进行麻醉后处死，经腹主动脉采血3 ml，拟行肝功能(ALT、ALP、GGT、TBIL)检测。解剖小肠组织，并行环形切取，生理盐水冲洗，尽量将组织平展，之后用4 %多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片。另取部分小肠组织置于2.5 %的戊二醛固定，送电镜室观察。

3 观察项目及方法 一般情况观察。肝功测定：将抽取的动脉血在冰上静置30 min 后，按4000 r/min离心10 min，小心吸取上层清亮血清，全自动生化分析仪检测肝功能(ALT、ALP、GGT、TBIL)数值。肠组织HE染色：取部分小肠组织，按照病理组织标准流程制作电镜组织切片以及苏木精-伊红染色组织片，评估各组组织学形态变化。肝组织NF-κB检测：取48 h时各组肝脏组织大小为15 mm×12 mm×5 mm置入EP管中，做肝组织匀浆，离心后提取上清液于EP管中，ELISA法检测匀浆中NF-κB量，操作按照试剂盒说明进行。

4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，统计方法选择One-WAY ANOVA方差分析法，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 各组一般情况比较 空白组：在造模过程中毛色光亮，活动灵敏，进食量及尿色均良好。模型组：造模过程中毛色暗淡，活动迟钝，进食量减少，尿色较空白组对比明显加深。中药组：与模型组比较，中药组大鼠活动、进食量及尿色均明显改善。

2 各组生化指标比较 如表1所示，与空白组比较，中药组与模型组大鼠均出现ALT、ALP、GGT、TBIL的迅速升高。中药组24 h与模型组24 h比较，ALT及TBIL明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。在造模48 h后，中药组与模型组ALT、TBIL均达到高峰，且两组对比差异具有统计学意义(P<0.05)。造模72 h后，中药组与模型组ALT、TBIL均较同组造模48 h下降，且两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。而在造模后24 h及48 h两个时间点比较，中药组的 ALP、GGT均低于模型组，但均无统计学差异；至造模72 h后，中药组ALP、GGT指标改善明显优于同期模型组，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 各组肠黏膜HE染色比较 空白组的肠黏膜结构正常，清晰完整，且绒毛排列整齐。造模24 h后，模型组肠黏膜结构破坏，可见肠黏膜绒毛不同程度缩短、断裂。与模型组对比，中药组的肠黏膜结构破坏和绒毛结构改变均较轻。造模后48 h及72 h，模型组出现较严重的肠黏膜绒毛改变，绒毛不同程度坏死、脱落，萎缩，排列杂乱，同时期中药组较模型组病理改变较轻。

4 各组肝组织中NF-κB检测比较 见表2。中药组与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 各组肠黏膜改变情况(HE染色，×100)

组 别nALT(U/L)ALP(μmol/L)GGT(U/L)TBIL(μmol/L)空白组48 h1040.90±3.67207.70±25.822.45±0.620.40±0.14模型组24 h101039.70±155.56559.30±53.296.73±0.8776.86±5.27模型组48 h101332.00±229.53772.30±51.377.53±1.06199.10±37.36模型组72 h10466.60±132.10784.20±50.528.41±0.80108.75±24.32中药组24 h10689.80±107.22∗505.40±58.566.48±0.7649.39±6.30∗中药组48 h10971.50±115.32∗710.40±42.107.29±0.64140.49±26.32∗中药组72 h10206.20±74.49∗713.10±31.69∗7.35±0.62∗59.45±12.89∗

注：与同期模型组比较，*P<0.05

表2 各组大鼠肝组织NF-κB的变化(ng/L)

注：与模型组比较，#P<0.01

讨 论

急性肝内胆汁淤积时，胆汁流入十二指肠发生障碍，造成肠黏膜屏障及肠道内微生态的破坏，肠道大量内毒素和细菌通过受损的肠黏膜屏障易位进入门静脉系统并释放出多种细胞因子和炎症介质，使得肠黏膜屏障解剖和功能的完整性发生进一步破坏，而淤胆造成的肝细胞炎症损伤又进一步加重胆汁淤积，持续破坏肠道黏膜屏障，导致了病情的持续进展。本实验发现与模型组对比，灌服茵陈蒿汤的大鼠病理学显示小肠肠腔仅轻度扩大，小肠肠黏膜结构破坏和绒毛结构改变均较轻。提示本方可能通过改善肠黏膜上皮细胞之间的紧密连接从而改善肠黏膜通透性，减轻肠组织损伤。

NF-κB是处于炎症及免疫反应风暴中心的关键细胞因子，其与多种细胞因子的合成与释放密切相关[8]。胞浆中大量活化的NF-κB复合物进入细胞核内，可以诱导炎症基因的转录与表达，同时还可刺激多种细胞因子的表达(如TNF-α、IL-2、IL-6)，而诸多细胞因子的过表达又可反向增强NF-κB的活化，造成持续的炎症反应，出现炎症细胞因子“瀑布样”效应[9]。急性肝内胆汁淤积时，肠道黏膜机械屏障完整性被破坏，肠道内大量细菌及内毒素发生移位，刺激肝脏NF-κB的持续高表达，NF-κB的高表达进一步导致肝功能的恶化甚至肝衰竭的发生。本次实验结果显示茵陈蒿汤可下调肝组织NF-κB的过度表达，其机制可能与茵陈蒿汤保护肠黏膜屏障，降低了肠道黏膜通透性，从而减少了肝组织NF-κB的表达。

茵陈蒿汤是临床治疗肝内胆汁淤积湿热证型最常用的方剂之一。方中茵陈蒿为君药，清热利湿、疏利肝胆;臣以栀子清泄三焦火热，利湿退黄;而大黄具有通导湿热以泄邪外出的功效，为佐药。茵陈蒿汤可通过调控肝胆细胞膜相关转运蛋白的表达、促进胆红素代谢、抑制氧化应激等各方面治疗急性肝内胆汁淤积[10]。本研究提示茵陈蒿汤对急性肝内胆汁淤积大鼠肠道黏膜的保护机制可能与上调肠黏膜机械屏障中的紧密连接相关蛋白，减少肠黏膜通透性，降低了肝脏NF-κB的表达有关。本研究证实了茵陈蒿汤治疗急性肝内胆汁淤积的有效性，为茵陈蒿汤在肝内胆汁淤积中的应用提供了实验证据。