电针对慢性应激抑郁模型大鼠脑组织内大麻素水解酶的影响*

刘 娟，田 磊，赵 杨，陆 健，雷正权，杜 旭，刘继平

1.陕西中医药大学(咸阳 712046)； 2.陕西省宝鸡市中医医院(宝鸡721000)

抑郁症(Depression)主要是以显著且持续性的心情低落与兴趣及欢愉感缺失为主要特点,同时还伴有疲劳,注意力不集中,有较明显的自杀欲望等其他症状的一种情感障碍类疾病[1],属于中医“郁证”、“脏躁”等疾病范畴。

抑郁症的发病机制尚不完全清楚，近年来，有研究认为内源性大麻素信号传递受损是引起抑郁症症状的主要原因。现已证实，内源性大麻素配体主要的水解酶之一——脂肪酞胺水解酶(FAAH)对内源性大麻素信号强度的调节起着重要的作用[2]。研究表明，使用FAAH抑制剂或采用FAAH基因敲除的方法都能使实验大鼠产生抗焦虑和抗抑郁样作用[3-4]。作为传统疗法针刺可以明显改善抑郁症患者的睡眠障碍，认知障碍，焦虑，迟滞等症状[5]。针刺与单纯抗抑郁药物治疗相比，有着安全，经济，副作用少的优势。本研究拟通过观察电针对慢性应激抑郁模型大鼠脑组织中FAAH的影响，探讨电针抗抑郁的可能机制。

材料与方法

1 实验动物与分组 SPF级SD雄性大鼠30只，体重(200±20) g。由西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物许可证号为：SCXK(陕)2012-003。采用孤养方式单笼喂养，饲养温度18 ℃～23 ℃，相对湿度在50%～70%。动物适应喂养1周后，接受1周饮用蔗糖水训练，防止动物对糖水产生偏好。于实验前动物禁食禁水12 h后，测晚间1h内蔗糖水摄入量，根据每只老鼠蔗糖水摄入量，将所有动物随机分为空白组、模型组、模型+电针组。每组10只。

2 试剂与器械

2.1 主要试剂：Rabbit Anti-FAAH(一抗)(批号AF0304117，北京博奥森生物技术有限公司)，生物素化山羊抗兔IgG、SABC、DAB显色试剂盒等(均为武汉博士德生物工程有限公司)。

2.2 主要实验仪器与设备：华佗牌电针仪(SDZ-Ⅱ型)，苏州医疗用品厂有限公司；研究级正置显微镜Zeiss Sxiolmager Al配Nikon DXM1200F；轮转切片机R136型，湖北泰维科技实业有限公司；Morris水迷宫(RD1101-MWM-M)，上海移数信息科技有限公司；TC-120S型智能程控生物组织自动脱水机，湖北泰维科技实业有限公司。

3 动物模型制备 采用孤养结合慢性温和不可预见性应激(CUMS)方法造模[6]。大鼠随机接受21 d不同的应激刺激，包括: 24 h禁食，24 h禁水，12 h的夜间光照，5 min的冷水游泳(4℃)， 30 min振荡，2 min的夹尾，3 h的束缚。每天随机安排1种刺激方式，在实验全程中每种刺激使用3次。

4 研究方法 ①空白组：正常喂养大鼠，共21 d。②模型组：建立CUMS抑郁症大鼠模型，共21 d。③模型+电针组：于造模的第1天起，于每日上午进行造模前1 h给予电针治疗，再随机进行一种造模方法，共21 d。具体操作：选取“百会”、“内关”、“阳陵泉”,参照《实验针灸学》[7]、《大鼠图谱的研制》[8]结合动物比较学方法定位。各穴针刺得气后，行电针治疗，一侧百会、内关接一组电极，另一侧内关、阳陵泉接一组电极，采用疏密波(疏波3Hz，密波15Hz)，电流量1.5mA，以引起大鼠肢体轻微抖动为度，两组交替。留针30 min，1次/d。

5 行为学指标检测

5.1 蔗糖水摄入实验:在实验第21天结束后，禁食禁水12 h，对各组大鼠检测蔗糖水摄入量。每次检测时，为避免动物对饮水瓶的位置发生偏好，将两个饮水瓶的位置进行调换。

5.2 旷场试验:制作周边为80 cm×80 cm×40 cm的不透明立方型敞箱，在箱底用白线划分为25块面积相等的方格。整个实验过程在室内隔音且安静状态下进行，在敞箱底面的中心方格内放置大鼠，然后记录3 min内大鼠的活动。以大鼠双后肢穿越敞箱底面的正方形块数为水平穿越格数、以双前肢离开地面直立数作为大鼠的垂直竖立活动次数，每只动物在整个实验中测2次，分别于实验前1天和实验第21天结束后进行。

6 取材及指标检测

6.1 各大鼠组织样品的制备:各组大鼠经过行为学检测后，将大鼠以l%戊巴比妥钠按40 mg/kg经腹腔注射麻醉。行4%多聚甲醛灌注固定后，剥离脑组织，分离出海马体，放入多聚液中固定1 h后，进行梯度脱水直至组织完全沉底。将海马体用蜡块包埋后，置于切片机上切成厚度5 μm的冠状切片，常温保存。

6.2 SABC免疫组织化学染色法:将上述的组织切片采用SABC免疫组化法检测FAAH。其步骤：切片按常规步骤脱蜡至复水。PBS缓冲液浸泡5 min×2遍，纯水室温封闭5 min，纯水冲洗3次。抗原修复。PBS缓冲液冲洗5 min，滴加BSA，室温静置30 min。甩掉液体，滴加一抗，4 ℃环境下过夜。PBS洗3次，每次2 min,滴加生物素化二抗，室温静置30 min。PBS洗3次，每次2 min，滴加试剂SABC，室温静置20 min。PBS液浸泡4遍，每次5 min。DAB显色。脱水，透明，封片。

采用IPP6.0图像分析软件对FAAH的表达进行定量分析。每张切片随机取3个高倍视野(×400)，测定每个视野下染色的阳性细胞个数。以每张片子3个视野的阳性细胞个数的平均值作为该片子的测量值。

7 统计学方法 统计方法采用SPSS 22.0软件，所有数据用均数±标准差统计，组间比较采用t检验，P<0.05时，提示差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠蔗糖摄入量的变化 见表1。三组大鼠实验前蔗糖水摄入量无显著差异(P>0.05)；空白组与模型组大鼠实验后的蔗糖水摄入量有极显著差异(P<0.01)；模型组与电针组大鼠实验后蔗糖水摄入量有显著差异(P<0.05)。

表1 实验前后蔗糖水摄入量变化(ml)

注：与空白组比较,*P<0.01；与模型组比较,#P<0.05

2 旷场试验(Open-field test) 由表2可见,三组大鼠实验前水平穿越格数和竖立活动次数无显著差异(P>0.05)；空白组与模型组大鼠实验后水平穿越格数和竖立活动次数有极显著差异(P<0.01)；模型组与电针组大鼠实验后水平穿越格数和竖立活动次数有显著差异(P<0.05)。

表2 实验前后旷场试验变化(格/次)

注：与空白组比较,*P<0.01；与模型组比较,#P<0.05

3 电针干预对各组大鼠海马FAAH阳性细胞个数平均值的影响 由表3和图1可以看出, 空白组与模型组相比，其FAAH的阳性细胞个数平均值有明显差异(P<0.01)；模型组与电针组相比，其FAAH的阳性细胞个数平均值有差异(P<0.05)；说明FAAH含量的变化与抑郁症有明显关联性，而电针干预可调节海马中FAAH的表达。

表3 FAAH的阳性细胞个数平均值(个)

注：与空白组比较,*P<0.01；与模型组比较,#P<0.05

图1 各组大鼠海马中FAAH的表达(SABC染色，×400)

讨 论

当前围绕抑郁症构建的动物模型有多种，其中慢性轻度不可预见性应激(CUMS)抑郁模型,其原理更接近人类抑郁症患者中慢性、低水平的应激源促进疾病发生发展的过程，以人类抑郁症的临床核心症状即快感缺乏作为造模成功与否的关键[9]。本实验采用CUMS方法所造模型的模型组大鼠，其糖水消耗量减少，表明动物奖赏反应水平减弱，其水平运动和竖立运动分值均下降，反映出其活动度和对新鲜环境的好奇度减弱，与空白对照组大鼠在行为学方面的比较有显著性差异。上述结果提示本模型造模成功。

目前，对于抑郁症的发病机制还不太清楚,存在着很多的假说, 近年来又一新的假说认为内源性大麻素信号传递受损是引起抑郁症状的主要原因。内源性大麻素系统(ECS)主要包括大麻素受体1(CB1)和大麻素受体2(CB2)两型受体,N-花生四烯酸氨基乙醇(AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-AG)两型配体,以及脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酞基甘油脂酶 (MAGL)两种相关的蛋白水解酶。大脑区域内的2-AG主要由MAGL降解，也有一部分由FAAH降解。使用FAAH抑制剂或敲除FAAH基因均可对抑郁模型动物在强迫游泳实验、悬尾试验中产生显著的抗抑郁作用[3-4]。强迫游泳试验中抑郁模型动物的AEA含量显著降低，在微量注射AEA后可缓解其抑郁样表现。同时，有临床研究也发现抑郁症患者FAAH-mRNA表达量明显低于健康组，证实了FAAH-mRNA表达水平与抑郁症患者的认知障碍具有相关性[10]。本研究结果显示，经21 d的造模后，模型大鼠海马组织内FAAH的表达明显低于正常大鼠，说明内源性大麻素系统有损伤，与现有的研究结果一致。经电针治疗后，大鼠海马组织内FAAH的表达显著高于模型组，说明电针可以调节大鼠脑内FAAH的表达。

抑郁症在祖国医学中属于“郁证”的范畴，中医认为，郁证病位在脑，发病与肝的关系最为密切，涉及心、脾，肝失疏泄、脾失健运、心失所养、脏腑阴阳气血失调为本病主要病机。本研究通过电针百会、内关、阳陵泉三穴，激发经络气机，以达到醒脑调神，疏肝理气，安志解郁的功效。本研究结果表明，电针具有明显的抗抑郁作用，其作用机理可能是通过对抗内源性大麻素系统的损伤而实现的。