早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠大脑白质有髓神经纤维总体积的影响

李佩春， 罗南， 李晓捷

众多的病理解剖研究证实大多数的未成熟儿伴随着损害扩散可最终发展成为脑白质的萎缩和巨脑室，还有一部分的临床后遗症是囊腔的形成和代偿的神经胶质过多症等，对于其中构成白质主要成分的有髓神经纤维的结构和功能的改变将是导致神经学异常及脑性瘫痪的主要病理学基础[1-2]。如何解决中枢神经纤维的损伤后再生，一直是近些年来神经科学方面的热点之一。而体视学作为一种新型形态学三维计量工具，能更好阐述神经超微解剖结构的变化[3-5]，目前对小儿脑损伤中白质损伤有髓神经超微结构的定量研究还没有相关报道。本研究应用体视学技术探讨早期干预及康复训练对宫内感染致脑损伤仔鼠脑白质有髓神经纤维总体积的影响，来揭示其促进脑损伤患者运动功能康复的病理学机制，为临床早期积极的应用环境康复疗法治疗发育期脑损伤提供基础理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级Wistar大鼠75只，雌雄比例2∶1，雌性体质量230～260 g，雄性260～300 g，由佳木斯大学实验动物中心提供；脂多糖(脂多糖血清型055：B5美国Sigma公司)；锇酸(佳木斯电镜中心购于英国)；透射电镜(日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备与分组 于17时将Wistar大鼠以2∶1合笼，次日上午8时查阴道涂片，以查得精子为妊娠第0天，孕鼠另笼饲养。将受孕的36只大鼠按随机数字表法分为对照组6只和脂多糖组30只。给孕第17天的脂多糖组孕鼠脂多糖450 μg/(kg·d)，连续2 d腹腔注射，而对照组孕鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。孕22 d前分娩的仔鼠为早产鼠。两组均去除早产鼠。仔鼠出生后，取胎盘做苏木精-伊红染色观察宫内感染情况。判断标准为大量中性粒细胞浸润。随机选取对照组仔鼠6只为生理盐水组，选取脂多糖组仔鼠12只分为干预组和非干预组各6只。3组仔鼠均于恒温恒湿环境中，母乳喂养。

1.2.2 行为疗法干预 (1)早期触摸：将2日龄干预组仔鼠托至掌心，用毛刷从头到尾匀速有力刷动，每次持续15 min，每日1次，同时给予声音和灯光刺激，干预至14日龄。(2)丰富环境刺激：将7日龄干预组仔鼠每日暴露于丰富环境中2 h，每日1次。60 cm×45 cm×45 cm笼内放置不同颜色及形状的物体，包括转盘、管道、阶梯、摇铃、秋千、水面等，每周将环境改变2次，以造成新异刺激，干预至28日龄。非干预组、生理盐水组分别饲养于20 cm×30 cm×45 cm标准笼内，不予干预。(3)康复训练：将15日龄至4周龄干预组仔鼠进行康复训练，每日1次。训练方法:①跑笼训练:采用圆形转笼训练器材，转笼直径25 cm，内径5 cm，底座有一固定架，跑笼训练可训练大鼠的抓握、行走、奔跑等运动，每次10 min；②转棒训练:一根长150 cm，直径4.5 cm的转棒；中点固定于3 r/min转动器上，顺、逆时针交替转动，每次10 min；③平衡木训练:平衡木长170 cm，宽2 cm，平放距地面7 cm处，每次10 min。可训练平衡功能。

1.2.3 体视学方法 (1)心灌流固定经4%的水合氯醛腹腔麻醉后，用2%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛混合固定液(pH 7.4)进行心灌流固定。去除头骨、小脑、脑干，剪断颅神经后将大脑完整取出。(2)用6%的琼脂分别包埋左右大脑半球，待琼脂凝固后，将大脑半球沿冠状线切成1 mm厚的连续等距切片，随机抽取每只仔鼠大脑一侧半球，在抽取出的每个大脑半球中，每3张大脑切片抽取1张。(3)在抽取出的大脑组织薄片上随机叠放等距测点框，在解剖显微镜下计数所有落在白质断面上的测点，根据卡瓦列里原理计算出整个大脑白质的总体积。V(wm)=t×a(p)×∑p(wm)，式中V(wm)代表白质的总体积，a(p)为每一测点所对应的面积(0.25 mm2)，t为切片厚度1 mm，∑p(wm)所有的与白质重叠的计数。(4)在测点击中白质的地方抽取白质组织块，这样可以保证每个部位抽中的概率都相等，平均每个大脑半球抽取3个白质组织块，用球切法包埋组织块以保证各个方向分布的神经纤维都有相同的抽样概率，再用前述常规电镜包埋法包埋白质组织块。从包埋好的组织块上随机切取一张60 nm的超薄切片，随机选择3个视野并放大6 000倍拍照。(5)有髓神经纤维总体积：在6 000倍放大的照片上随机叠加具有等距测点的透明测点框，计数落在整个白质区域内有髓神经纤维上的测点数。根据公式：V(mnf)=Vv×V(wm)计算出白质内有髓神经纤维总体积。式中V(mnf)代表有髓神经纤维总体积，Vv为有髓神经纤维的体积密度，而Vv=∑P(mnf)/∑P(wm)式中，∑P(mnf)为落在神经纤维上得测点数，∑P(wm)为落在整个白质内的测点数和V(wm)代表白质总体积。

1.2.4 超微标本制作流程 (1)组织切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，先用3%戊二醛固定2～4 h。(2)用0.1%磷酸缓冲液漂洗4 h以上，4 ℃，换5次漂洗液。分出小部分标本备用。(3)用1%锇酸-0.1%二甲胂酸钠缓冲液固定2 h。(4)用缓冲液或双蒸水漂洗5 min。(5)用50%、70%、80%、90%乙醇、90%丙酮脱水10 min，100%丙酮3次，每次10 min。(6)临时配制环氧树脂包埋剂，按下列浓度浸透，丙酮：包埋剂=1∶1，浸1 h。丙酮：包埋剂=1∶3过夜。(7)用新鲜包埋剂包埋，加上编号标签。(8)聚合：35 ℃过夜，60 ℃ 24～48 h。(9)切1～2 μm半薄切片，对照定位后，60～80 nm超薄切片。(10)切片染色：用醋酸铀饱和水溶液染后再用枸橼酸铅染色。

2 结果

2.1 各组仔鼠脑白质有髓神经纤维总体积比较 见表1。

表1 各组仔鼠脑白质内有髓神经纤维总体积比较

注：与生理盐水组比较，aP<0.01；与干预组比较，bP<0.01；与14 d比较，ct=-18.55，-10.76，-3.10，P<0.05。

表1结果表明，非干预组和干预组仔鼠14 d和28 d有髓神经总体积和白质总体积显著低于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.01)。非干预组仔鼠28 d有髓神经纤维和白质总体积显著低于干预组，差异有统计学意义(P<0.01)；干预组和非干预组仔鼠14 d有髓神经纤维和白质总体积比较差异均无统计学意义(P>0.05)。生理盐水组和干预组28 d有髓神经纤维总体积显著高于14 d，非干预组显著低于14 d，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组白质有髓神经纤维透射电镜结果 见图1。

图1 各组白质有髓神经纤维透射电镜观察情况(×6 000)

3 讨论

早产儿脑室周围白质软化是指早产未熟儿由于某些原因导致的脑室周围深部白质的缺血凝固性坏死。大量文献表明，脑室周围白质软化是脑损伤及脑性瘫痪的主要神经病理改变，是影响存活患儿行为功能障碍和神经系统发育的最主要原因，由于脑白质主要由神经纤维及神经胶质细胞构成[6-7]，故研究干预措施对有髓神经纤维超微结构变化是目前研究的热点。

体视学的应用使得经典的形态学观察发生革命性变化，摒弃传统的二维视角，把二维平面还原为三维立体，实现了细胞形态从定性研究走向定量法研究质的飞跃。Pakkenberg等[8]运用体视学方法测定老年的脑白质体积降低约28%，Marner等[9]在国际上首次阐述了定量研究大脑白质有髓纤维的体视学方法。但是在先天性脑损伤病中，国内外用体视学方法研究尚未见报道。

本实验首次用体视学方法研究宫内感染致脑损伤的有髓神经改变进行了相关研究，研究结果如下：(1)生理盐水组从生后14 d到发育的关键期28 d，白质总体积从原先的52.77 mm3到82.76 mm3，其中有髓神经纤维的总体积从原先的12.99 mm3到32.77 mm3。两者的增长比例分别为38%和61.5%，体现了神经随着生长呈现出一定的大体上的发育，而且大脑白质的变化主要由其中神经纤维的增长引起。(2)干预组第14天白质总体积较生理盐水组减少24.6%而到28 d时的37.5%，有髓神经总体积相比下降34.4%到28日龄的57.8%。(3)非干预组第14天的白质总体积较同日龄生理盐水组减少27%而到28 d时的60.9%，有髓神经总体积相比下降了43.5%到28日龄的81.3%。(4)干预组较非干预组比较有髓神经纤维总体积的增加有显著差异。

在人类的早产儿脑损伤致死的尸检报告中显示，早期脑室周围白质软化，脑白质损伤区可见炎症细胞在坏死区聚集现象，而在后期的改变主要以脑室周围囊腔形成为特征，并囊腔周围存在强烈的星型细胞增殖和纤维化。在本实验研究中，第14天时干预组与非干预组的白质总体积比较无统计学意义，而有髓神经总体积有差异，提示脑损伤后由于白质内有髓神经纤维存在自身修复的缘故，通过侧支长芽等方式促进受损神经再生和修复。基本与脑室周围白质软化早期损伤大体标本一致。同时在非干预组的投射电镜中观察到受损区存在再生修复的纤维结构形态(修复的纤维结构末端髓鞘较薄，而且形态不规则)，也证实了上述观点。但在第28天的对比中发现，干预组与非干预组较同日龄的生理盐水组相比结果分别为：有髓神经总体积减少的程度分别为58.3%和82.2%，说明非干预组自身增生的程度有限，而且随着发育，有髓神经纤维的损伤将难以恢复或有加重的趋势。可能是中枢神经有髓神经纤维主要是由多个少突胶质细胞的胞突缠绕构成，而它可以在发育中具有缠绕髓鞘的能力，而且一直维持到成年。当在发生急性慢性脱髓鞘病变的时候，自身修复作用能使其一定程度上代偿修复。如果不及时干预治疗，随着神经的发育，脑白质及其内的有髓神经纤维的损伤程度会呈现上述实验中加重的趋势。干预组能一定程度的促进神经再生，考虑主要的机制是：是由于康复训练改变了脑组织中的微环境，增加树突棘分支及密度，提高损伤区皮质突触膜糖蛋白的表达及神经干细胞分化及迁移能力，抑制脑缺血再灌注导致的X染色体连锁的凋亡抑制蛋白mRNA表达，诱导损伤区神经生长因子、转化生长因子等神经营养因子的表达，来影响大脑的再生修复，促进神经的可塑性。国内对短期丰富环境刺激对老年大鼠脑白质及白质内有髓神经的影响研究中，发现丰富环境对有髓神经纤维的总体积有一定的影响[10]。本研究与上述研究的结果基本一致。

由于观察的时限较短，饲养食物量不同，实验处理时纤维等物质的缩水率因素影响，本实验中只是计算出神经纤维总体积的大体情况，而没有把损伤中活跃增生的部分区别出来加以区别，为了研究宫内感染对脑白质损伤的长期影响，还需要大样本，利用先进的标记技术做进一步的测量。