基于数据挖掘分析NAMPT在脑胶质瘤中的表达及意义*

苟小霞，阮培刚，徐颖，王彦哲，徐晖，曾令秀，张贵海

553003贵州 遵义，遵义医科大学附属医院 头颈肿瘤科

近几年来，随着高通量测序的发展，研究者们越来越趋向于将细胞和组织生物学表达谱数据存储于各大数据库中，并依赖于科学的信息理论、方法和技术来查询、管理、分析和利用生物分子的数据，找到其中的差异变化，以制定最佳的临床治疗。其中，Oncomine是目前世界上最大的肿瘤基因芯片数据库和整合数据提取平台；迄今为止，该数据库收录了715个基因表达数据集，包含86 733个样本的芯片结果，拥有最全的临床预后资料[1]。脑胶质瘤是一种恶性程度极高的肿瘤，各种治疗手段的效果均不佳，患者预后极差[2]。为此，我国于2007年启动了基于中国人群的中国脑胶质瘤基因组图谱计划(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)，现已完成转录组测序600多例[3]，以期利用数据库挖掘潜在的肿瘤基因，分析基因的功能，探索基因在肿瘤中的表达情况并进行临床预后的相关分析，从而找到新的生物标志物和新的治疗靶点。

烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)补救合成途径的关键限速酶，参与细胞能量代谢，调控细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学过程。NAMPT在多种实体瘤包括结直肠癌、胃癌、乳腺癌组织中明显升高，且与患者生存和肿瘤分期呈负相关[4]。本研究通过Oncomine数据库挖掘NAMPT在胶质瘤中的表达情况，提取CGGA胶质瘤生存数据分析其表达水平与患者预后之间的关系，为进一步研究NAMPT在胶质瘤中的意义奠定基础。

1 资料与方法

1.1 利用Oncomine数据库提取数据

筛选条件如下：①“Cancer Type: Brain and CNS Cancer”;②“Gene：NAMPT”；③“Data Type：all”;④“Sample Type: Clinical Specimen”;⑤“Analysis Type: Cancer vs．Normal Analysis”;⑥临界值设定条件Pvalue<1×10-4，fold change>2, gene rank=top 10%.

1.2 统计学分析

胶质瘤病例组与癌旁正常组织之间NAMPT表达差异采用t检验。NAMPT表达与胶质瘤预后的关系采用GraphPad Prism 7.0进行统计学分析，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NAMPT在所有肿瘤类型中的表达

Oncomine数据库中共收集了有关NAMPT的研究结果共426项，在设定的搜索条件下表达有统计学差异的研究结果有43项，其中NAMPT表达增高的有 24项，表达降低的有19项，且主要集中在中枢神经系统肿瘤、结直肠癌等，在中枢神经系统肿瘤中表达增高的研究有8项，包括胶质母细胞瘤6项，间变星形细胞瘤1项，间变少突细胞瘤1项;没有表达降低的研究(表1)。

表1 NAMPT在Oncomine数据库中所有肿瘤相关研究中的表达

Table 1. Up-regulated and Down-regulated Expression of NAMPT in Studies from Oncomine Database

Type of cancerUp-regulated(n)Down-regulated(n)Bladder cancer -1Brain and CNS cancer 8-Breast cancer-2Cervical cancer--Colorectal cancer7-Esophageal cancer-2Gastric cancer --Head and neck cancer--Kidney cancer4-Leukemia -8Liver cancer -2Lung cancer -1Lymphoma 22Melanoma--Myeloma--Ovarian cancer--Pancreatic cancer --Prostate cancer--Sarcoma-1Other cancers3-

2.2 NAMPT在胶质瘤中的表达情况

我们发现在Oncomine数据库中，从2001年起共有10项研究涉及NAMPT在胶质瘤组织和正常组织中的mRNA水平表达。文章分别发表于Journal of clinical oncology[5],Cancer Cell[6],Oncogene[7],Cancer research[8],Cancer Cell[9],TCGA(数据未发表),Cancer research[10-12]。Meta分析显示，与癌周正常的脑组织相比较，胶质瘤组织中NAMPT呈高表达(P<0.001)。见表2和图1。

表2 NAMPT在胶质瘤mRNA水平的过表达情况

Table 2. Detailed Information of NAMPT Expression in Glioma

Data (n)Study objectFold ChangetPMurat, Brain(84) [5]Glioblastoma vs normal3.13711.329<0.001Lee, Brain(101) [6]Glioblastoma vs normal6.72810.895<0.001Shai, Brain(42) [7]Glioblastoma vs normal3.0736.191<0.001Bredel, Brain(54) [8]Glioblastoma vs normal4.6858.398<0.001Sun, Brain(180) [9]Glioblastoma vs normal3.80310.732<0.001Sun, Brain(180) [9]Anaplastic astrocyma vs normal3.7874.372<0.001TCGA, Brain(557) ∗Glioblastoma vs normal7.50818.420<0.001French, Brain(33) [10]Anaplastic oligodendroglioma vs normal2.6014.717<0.001Rickman, Brain(51) [11]Astrocytoma vs normal2.3324.221<0.001Gutmann, Brain(15) [12]Pilocytic astrocytoma vs normal1.8702.1050.034

*Data unpublished

图1 Oncomine 数据库中NAMPT在胶质瘤研究中的汇总表达情况

Figure 1. The NAMPT Expression of Glioma in Studies from Oncomine Database

Thefigureindicates10meta-analysesofNAMPTgeneexpression.ThecoloredsquaresrepresentthemedianofNAMPTcomparedtonormaltissuein10studies.ThePvalueforageneisitsPvalueforthemedian-rankedanalysis.

2.3 NAMPT在不同类型脑胶质瘤芯片中癌组织和正常组织之间的表达差异

我们分别选择星形细胞瘤[11]、间变星形细胞瘤[9]、间变少突细胞瘤[10]、胶质母细胞瘤(数据未发表)中样本量最大的研究进行分析。在这4项研究中，NAMPT在不同类型脑胶质瘤中的表达水平均明显高于癌旁正常组织(均P<0.01)。见图2。

2.4 NAMPT表达与胶质瘤预后的关系

NAMPT在胶质瘤中表达增高，为了进一步明确NAMPT表达与胶质瘤预后的关系，我们在CGGA数据库[2-3]提取WHO病理分级为II级，包括星形细胞瘤60例、少突神经胶质瘤18例、少突细胞瘤37例，III级包括间变性星形细胞瘤9例、间变性少突神经胶质瘤9例、间变性少突细胞瘤17例，IV级为胶质母细胞瘤106例。分为NAMPT高表达组及低表达组，通过Kaplan-Meier分析发现，在II级胶质瘤中，高、低表达组的差异无统计学意义，在III级胶质瘤中，高表达组预后差于低表达组，但无统计学意义(P=0.197)；在胶质母细胞瘤中，高表达组预后明显差于低表达组(P=0.014)(见图3)。

图2 Oncomine 数据库中NAMPT在不同类型胶质瘤芯片中的表达情况

Figure 2. Expression of NAMPT in Different Glioma Chips from Oncomine Database

ThePvalueislowerthan0.001.Thefoldchangeisdefinedas2.(A)ExpressionofNAMPTinastrocytomaandnormaltissue; (B)ExpressionofNAMPTinanaplasticastrocytomaandnormaltissue; (C)ExpressionofNAMPTinanaplasticoligodendrogliomaandnormaltissue; (D)ExpressionofNAMPTinglioblastomaandnormaltissue.

图3 NAMPT表达与胶质瘤预后的关系

Figure3.RelationshipbetweenExpressionofNAMPTandSurvivalTimeofPatientswithGlioma

A. comparision of survival between NAMPT high-expression group and low expression group in patients with grade II gliomas; B. comparision of survival between NAMPT high-expression group and low expression group in patients with grade III gliomas; C. comparision of survival between NAMPT high-expression group and low expression group in patients with glioblastoma.

2.5 NAMPT的GO和Pathway注释

基因本体论(Gene Ontology)简称GO，现已成为生物信息学领域中用于功能富集分析的一个重要方法和工具。GO注释包括生物学过程、分子功能和细胞组分三个部分。通过NCBI基因数据库检索NAMPT参与的生物学过程包括有NAD代谢补救途径、非脂肪组织发育、细胞与细胞信号传导、昼夜节律调控、非胰岛素受体信号通路、正向调控细胞增殖、正向调控RNA聚合酶II转录、信号转导等。其分子功能有细胞因子活性、药物结合、蛋白结合、烟酰胺磷酸核糖转移酶活性等(表3)。通过Reactome数据库中检索NAMPT参与的Pathway有调节时钟基因的表达、维生素代谢、烟碱代谢等(表4)。

表3 NAMPT在NCBI中的GO分析

Table 3. GO Analysis of Expressed NAMPT in NCBI

Gene nameBiological ProcessMolecular functionCellular componentNAMPTSignal transductionCytokine activityCell junctionNOT adipose tissue developmentDrug bindingCytosolCell-cell signalingIdentical protein bindingExtracellular exosomeCircadian regulation of gene expressionProtein bindingNuclear speckCircadian rhythmProtein homodimerization activityFemale pregnancyNicotinamide phosphoribosyl transferase activityNOT insulin receptor signaling pathwayPositive regulation of cell proliferationPositive regulation of nitricoxide synthase biosynthetic processPositive regulation of transcription from RNA polymerase II promoterRegulation of receptor activityResponse to organic cyclic compoundNAD biosynthesis via nicotinamide riboside salvage pathway

表4 NAMPT在Reactome中的Pathway注释

Table 4. Pathway Annotation of Expressed NAMPT in Reactome

Gene namePathwayNAMPTCircadian clock(BMAL1:CLOCK,NPAS2 activates cir-cadian gene expression) Metabolism of vitamins and cofactorsMetabolism of water-soluble vitamins and cofactorsNicotinate metabolismNicotinamide salvaging

3 讨 论

胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤。根据中枢神经系统肿瘤的分类，胶质瘤可分为WHOⅠ～Ⅳ级胶质瘤，I、II级为低级别胶质瘤，III、IV级为高级别胶质瘤[13]。胶质瘤以手术治疗为主，术后辅以放疗、化疗、靶向治疗等综合治疗。目前高级别胶质瘤治疗后的预后较差，间变性胶质瘤患者的中位生存时间为2～3年，而胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仅1年[14]。由于高级别胶质瘤侵袭性高，即使经过手术切除联合术后给予替莫唑胺同步放化疗或替莫唑胺辅助化疗，仍有大多数患者会复发[15]。因此寻找新的小分子靶向化疗药物显得十分重要。

恶性增殖的肿瘤细胞需要源源不断的能量和代谢底物来维持生物大分子合成和内环境稳态[16]。与正常细胞不同，肿瘤细胞主要依赖糖酵解途径获得三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)为自身快速增殖和生存提供能量[17]。此外，糖酵解过程中产生的大量中间代谢产物，可作为脂肪、蛋白质和核酸等生物大分子的合成原料，而乳酸进入间质后可以维持酸性微环境，有利于肿瘤细胞增殖转移，启动及参与肿瘤代谢重编程。因此，肿瘤细胞对糖酵解途径重要辅酶NAD的需求量较正常细胞明显增高。研究显示，肿瘤细胞通过主要补救合成途径获得 NAD，而NAMPT是该途径的关键限速酶[18]。NAMPT在结直肠癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、子宫内膜癌、黑素瘤等肿瘤中高表达[19]，与肿瘤的发生、发展有着密切的联系[20]。Lucena等[21]报道NAMPT 在胶质瘤细胞中高表达，与Nanog和CD133的表达成正相关；Meta分析显示，NAMPT在启动肿瘤干细胞通路中起到重要作用。Zhao等[22]研究发现NAMPT在黑色素瘤中高表达，与患者不良预后有关，而沉默NAMPT能降低NAD+代谢水平和抑制细胞增殖，通过NAMPT-E2F2-SIRT1信号轴介导黑色素瘤细胞对P53依赖的凋亡产生抵抗，可作为黑色素瘤的预后指标及治疗靶点。这些研究提示，NAMPT影响着恶性肿瘤的增殖、转移、复发，在肿瘤发生、发展中起着重要的作用。

我们通过对Oncomine基因芯片数据库的深入分析，发现NAMPT在胶质瘤、结直肠癌、肾癌及其他肿瘤中高表达，在乳腺癌、食管癌、肝癌、肺癌、软组织肉瘤中低表达。10项关于胶质瘤组织在mRNA水平的Meta分析显示，NAMPT在胶质瘤中显著高表达(P<0.001)。从中选取样本量最大的4项研究进行分析，NAMPT在星形细胞瘤、间变星形细胞瘤、间变少突细胞瘤、胶质母细胞瘤中的表达量均明显高于正常组织(均P<0.01)。通过CGGA数据库提取WHO II级115例、III级35例及胶质母细胞瘤106例。从生存曲线可以发现，病理级别越高，患者预后越差。在II级胶质瘤中，高表达组与低表达组之间的差异无统计学意义；而在III级胶质瘤中，高表达组的预后差于低表达组，但差异无统计学意义(P=0.197)，这可能是因为总病例数较少(35例)，需要进一步扩大病例数研究。在胶质母细胞瘤中，高表达组预后明显差于低表达组(P=0.014)，这与Gujar等[23]的报道一致。通过GO和Pathway分析，NAMPT参与NAD代谢补救途径、细胞与细胞信号传导、昼夜节律调控、胰岛素受体信号通路、细胞增殖、RNA聚合酶II转录调控等生物学进程，这为进一步深入研究NAMPT机制提供了方向。

综上所述，利用Oncomine数据库中肿瘤相关基因的深入分析，我们初步发现NAMPT在不同级别的胶质瘤中高表达；并且，在胶质母细胞瘤中，NAMPT高表达的患者预后更差。CGGA收集的是我国人群胶质瘤的芯片数据，更具有中国人群代表性。应用NAMPT抑制剂或许能够抑制 NAMP酶的活性，降低细胞内 NAD 的水平，减缓细胞能量代谢的速度而具有抗肿瘤作用[24]。因此，NAMPT可能是肿瘤治疗的新靶点，值得进一步研究。

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